lunes, 16 de junio de 2025

Biorreactores de Volumen de Nanolitros para el Cultivo Celular

Los biorreactores de volumen de nanolíticos para la frabricación de dispositivos microfluídicos consisten en microcanales grabados o estampados en sustratos hechos de polímero, vidrio o silicio. Las intrincadas conexiones de los microcanales a biorreactores con algunas estructuras mecánicas inteligentes como trampas o curvaturas cumplen las funcionalidades deseadas, como la mezcla, la separación, el control del flujo o el establecimiento del entorno para las reacciones bioquímicas. Aquí, describimos los métodos de fabricación de un microbioreactor termoplástico paso a paso. Primero, se realiza la selección del material; luego, se determinan los métodos de producción con el equipo que se puede adquirir fácilmente en un laboratorio. Se eligió COP (polímero de olefina cíclica) por sus características sobresalientes entre muchos polímeros. Se diseñan dos tipos de biorreactores de volumen, con y sin electrodos, utilizando los programas AutoCAD y L-edit. Se emplean la fotolitografía y el grabado electroquímico húmedo para la preparación del molde maestro. Se utiliza un evaporador térmico para la deposición de cromo puro y oro sobre el sustrato de COP, y se usan grabadores para formar los electrodos interdigitados. Una vez producido el molde maestro, se utiliza el termoestampado para obtener la forma diseñada en el COP perforado y planarizado. La cubierta de COP, con o sin electrodos, se une al COP termoestampado mediante termocompresión, y se realiza el dispositivo microfluídico termoplástico. Se conectan tubos al dispositivo y se establece un puente entre el macromundo y el micromundo. Células de levadura o de mamíferos marcadas o etiquetadas con GFP/RFP en productos genéticos específicos se cargan en el dispositivo microfluídico, y se recopilan datos en tiempo real sobre las dimensiones celulares y la intensidad de fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia invertido; finalmente, se utiliza el procesamiento de imágenes para analizar los datos adquiridos.


El éxito sin precedentes de la industria microelectrónica en la integración de dispositivos de biorreactores de volumen de tamaño micro y nano a muy altas densidades utilizando métodos de fabricación como la litografía, la deposición de películas delgadas y el grabado, allanó el camino para el desarrollo de plataformas microfluídicas. La fuerza impulsora de estas tecnologías siempre ha sido miniaturizar los sistemas de análisis bioquímicos de tamaño de escritorio. La principal ventaja de la miniaturización en estos sistemas es la reducción del volumen de la muestra y del reactivo. Los dispositivos microfluídicos también proporcionan una transferencia de calor más rápida, tiempos de proceso más cortos y una mejor automatización. Las aplicaciones biológicas y médicas en el cultivo celular, la detección de fármacos y los sistemas de punto de atención (POC) adoptan la tecnología microfluídica debido a la integración de varios pasos en plataformas únicas automatizadas, lo que las convierte en plataformas potentes para estudios de células individuales. El cultivo, la separación/aislamiento, la detección y el análisis de células individuales se pueden realizar correctamente dentro de los dispositivos microfluídicos a altas tasas de rendimiento, alta reproducibilidad y alta automatización, con un funcionamiento fácil y de bajo costo. Existe una demanda creciente de estas tecnologías microfluídicas en el mercado global. Este mercado se ha segmentado en hospitales y centros de diagnóstico, institutos académicos y de investigación, y compañías farmacéuticas y biotecnológicas. Los hospitales y centros de diagnóstico son las áreas con la mayor cuota de mercado en este campo. Las tecnologías microfluídicas continúan creciendo y desarrollándose con colaboraciones entre universidades e industrias.

La elección del material para los dispositivos microfluídicos es importante en el estudio de las células. En los últimos años, se han investigado materiales alternativos al vidrio y al silicio entre los materiales elastoméricos y termoplásticos. Los materiales termoplásticos compuestos por moléculas lineales y ramificadas son altamente preferidos debido a su fácil modificación de la superficie y su durabilidad contra los cambios de temperatura y presión en biorreactores de volumen, y tampoco sufren ninguna ruptura estructural. Sin embargo, no es fácil satisfacer los requisitos materiales de las aplicaciones biológicas específicas. Las propiedades ópticas, la termoestabilidad, la estabilidad química y la permeabilidad a los gases son los argumentos clave para la fabricación de dispositivos microfluídicos. Los chips termoplásticos deben ser biocompatibles para que las células sobrevivan y transparentes para poder monitorearlas. Por estas razones, el policarbonato, el polímero de olefina cíclica, el poli(metacrilato de metilo) y el poliestireno destacan en comparación con otros polímeros. Estos polímeros se utilizan comúnmente en la fabricación industrial y poseen excelentes calificaciones ópticas. Permiten la creación rápida de prototipos.

Los métodos de fabricación de los dispositivos termoplásticos son relativamente sencillos en biorreactores de volumen con tanques de acero. Las herramientas de fabricación son de bajo costo y fáciles de usar. El grabado húmedo, el mecanizado convencional, la fotolitografía, el termoestampado, el moldeo por inyección, la ablación con láser y la impresión 3D son algunos ejemplos de métodos de producción. La selección del método de fabricación depende de varios factores, como la disponibilidad de tecnología y equipo, el costo, la velocidad y la capacidad. En este capítulo, se explica la fabricación de dispositivos microfluídicos termoplásticos con y sin electrodos integrados para sistemas simples que no requieren componentes activos como microbombas, microválvulas y sensores. Se utilizan los métodos de fotolitografía, grabado, deposición, termoestampado y unión por termocompresión para la fabricación del dispositivo deseado y cada paso se explica en detalle.

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jueves, 5 de junio de 2025

Métodos de estado estacionario en biorreactores

Los métodos de estado estacionario en biorreactores se basan en una reacción química o bioquímica que ocurre en el líquido, el cual actúa como absorbente de oxígeno. El método de estado estacionario se basa en el flujo de oxígeno y la diferencia entre la concentración de O2 de entrada y la concentración de O2 de salida. Este enfoque permite que el kLa cambie con el tiempo con una reducción en la concentración de oxígeno. En otras palabras, este método utiliza el balance global de oxígeno en la fase gaseosa del reactor. Pueden ocurrir errores notables debido a la pequeña diferencia en la concentración de O2 entre las corrientes de gas de entrada y salida.

El kLa es una medida del uso de oxígeno en sistemas gas-líquido. El valor de kLa es muy importante en la síntesis de productos y biomasa, ya que la obtención metabólica de energía está relacionada con el oxígeno producido por los sistemas de ventilación. Muchas variables son efectivas en el valor de kLa, también conocido como eficiencia de aireación. Estos parámetros son principalmente: turbulencia en el tanque de ventilación, es decir, mezclado, presión del aire, caudal de aire, temperatura, propiedades del fluido (densidad, viscosidad, etc.) y la disponibilidad de inhibidores de espuma.


Para este protocolo de estado estacionario en biorreactores, el tipo de biorreactor elegido es un reactor de tanque agitado con dos deflectores. La capacidad del STR es de 3 L con un volumen de trabajo de 2 L.

  1. Esparcidor: Tipo orificio.
  2. Impulsor: Turbina Rushton de 6 aspas.
  3. Bomba de aire: Usar con tubos de silicona.
  4. Sonda de oxígeno disuelto: Tipo polarográfico.
  5. Detector de temperatura.
  6. Puerto de muestreo.
  7. Unidad de control del biorreactor: Monitorea la temperatura, la concentración de oxígeno disuelto, la aireación (caudal de gas) y la agitación (velocidad del agitador).
  8. Tanque de nitrógeno: Usar y organizar con regulador de presión.


Obtener el cultivo de reserva de Escherichia coli como organismo modelo para la producción aeróbica en biorreactor.


Preparar el medio de crecimiento Luria-Bertani (LB) en forma de caldo y agar para E. coli con los siguientes componentes para 1 L: 10 g de triptona, 10 g de NaCl, 5 g de extracto de levadura y agua destilada. Añadir agar-agar (2%) con estos componentes para el medio de agar.


Utilizar la concentración celular de E. coli a una longitud de onda de 600 nm.


Medir el tiempo y también obtener los valores de concentración de OD correspondientes a esos tiempos.


Instalación del Biorreactor

  1. Usar la forma de orificio del esparcidor de estado estacionario en biorreactores que es responsable de la entrada de burbujas de aire al biorreactor a través de la bomba de aire.
  2. Localizar el puerto de la turbina Rushton en el STR (ver Nota 5).
  3. Instalar el puerto de muestreo, el detector de temperatura y la sonda de OD de tipo polarográfico dentro del biorreactor.
  4. Esterilizar en autoclave el biorreactor con todas sus piezas colocadas dentro durante 20 min a 121 °C.


Preparación del Medio de Crecimiento

  1. Preparar medio de agar para mantener el cultivo de reserva en placas Petri o tubos inclinados. Pesar los componentes de triptona, NaCl y extracto de levadura más agar-agar según los volúmenes requeridos y mezclarlos en el agua destilada. Hervir la solución para homogeneización.
  2. Preparar los componentes del medio de caldo para la ampliación desde las placas Petri de agar hasta el volumen final de inoculación del biorreactor. Comenzar con volúmenes de 5 mL en tubos y continuar con volúmenes de 10, 20 y 40 mL, respectivamente. Pesar todos los componentes excepto el agar-agar y mezclarlos en el agua destilada en las cantidades requeridas.
  3. Preparar por separado el medio de crecimiento para el biorreactor en un volumen de 2 L.
  4. Medir los valores de pH de los medios de crecimiento y ajustar el pH a un rango entre 7.5 y 8.
  5. Esterilizar en autoclave todos los medios de crecimiento y equipos durante 20 min a 121 °C.
  6. Para el medio de agar: Poco después de la esterilización, verter el medio de caldo en condiciones asépticas en placas Petri/tubos estériles mientras la temperatura media es de aproximadamente 60 °C y dejar solidificar por enfriamiento.


Preparación del Microorganismo

  1. Inocular las células de E. coli en medio de agar con asa de inoculación en condiciones asépticas, primero. Cultivar las células a 37 °C.
  2. Después de que las colonias crezcan en la placa Petri, tomar una sola colonia de la placa y transferir a 5 mL de medio de caldo. Escalar hasta 40 mL de medio de caldo en un Erlenmeyer de 250 mL siguiendo el crecimiento del cultivo.
  3. Usar los 40 mL de cultivo para inocular el biorreactor.


Operación del STR

  1. Después del proceso de esterilización de estado estacionario en biorreactores, transferir el medio de crecimiento estéril al biorreactor en condiciones asépticas.
  2. Inocular el 2% (v/v) de las células correspondientes a 40 mL en el biorreactor en condiciones asépticas.
  3. Conectar la bomba de aire al cabezal del puerto del esparcidor con tubo de silicona.
  4. Operar el STR bajo condiciones adecuadas a 150 rpm y 1 vvm (37 °C) siguiendo las indicaciones de la unidad de control del biorreactor.


Medición del Coeficiente de Transferencia de Oxígeno: kLa

  1. Verificar continuamente la densidad óptica de las células para seguir el crecimiento.
  2. Después de que las células alcancen la fase de crecimiento logarítmico, estar listo para la determinación de kLa mediante el método dinámico en el biorreactor.
  3. Para la desoxigenación del caldo en ese momento, conectar el  tanque de acero  de nitrógeno.
  4. Inyectar gas nitrógeno en el biorreactor para desplazar el oxígeno.
  5. Usar la sonda de OD y monitorear los cambios en la concentración de OD.
  6. En este período, C disminuye.
  7. Después de observar el valor de OD como 0% de saturación (o cerca del 0%), cortar el suministro de nitrógeno.
  8. Después de que C disminuya, airear el caldo de fermentación mediante bombeo en condiciones de operación específicas, como un flujo de aire constante conocido.
  9. En función del tiempo, C aumenta. Monitorear este cambio en la concentración de OD siguiendo el inicio del flujo de aire (Fig. 1).
  10. Medir los valores de C en diferentes momentos en el biorreactor y registrar estos varios valores con respecto al tiempo usando un cronómetro para la gráfica.
  11. Asumir que la reoxigenación del caldo de fermentación es rápida en comparación con el crecimiento celular, de modo que el nivel de OD alcanzará un valor de estado estacionario en poco tiempo. C*, que es el valor de estado estacionario, muestra un equilibrio entre el suministro y el consumo de oxígeno.

Publicado en Aquí Métodos de estado estacionario en biorreactores

sábado, 31 de mayo de 2025

Medición del Coeficiente Volumétrico de Transferencia de Masa en un Biorreactor de Tanque Agitado

Un biorreactor de tanque agitado es un recipiente controlado que permite conversiones biológicas en componentes bioactivos utilizando células o enzimas. En los procesos aeróbicos, es importante conocer los requerimientos de oxígeno de las células, que pueden variar durante la fermentación como resultado de la actividad microbiana, el envejecimiento, el agotamiento del sustrato y la formación de productos, etc. Aquí describimos la medición del coeficiente volumétrico de transferencia de masa (kLa) en un biorreactor de tanque agitado utilizando el método dinámico basado en estado no estacionario, que también es un parámetro significativo, especialmente en la ampliación de escala. El equipo para la medición según el método dinámico tiene un bajo costo en comparación con la metodología de estado estacionario. Este método es confiable en la determinación de kLa cuando el tiempo de residencia del gas y la sonda que mide la concentración de oxígeno del tiempo de respuesta cumplen con requisitos específicos.

La transferencia de gas se define como el proceso en el que el gas se mueve de una fase a otra. Este fenómeno se utiliza en la transferencia de masa y la transferencia de oxígeno para la continuidad de los procesos biológicos durante la bioproducción en un biorreactor de tanque agitado. La transición de oxígeno de la fase gaseosa a la fase líquida es crucial para el proceso aeróbico, especialmente para: la producción de enzimas, la formación de productos relacionados con la biomasa, el tratamiento de aguas residuales y los cultivos de células animales.

Los microorganismos aeróbicos en el caldo de fermentación producen la energía necesaria para su supervivencia y crecimiento utilizando moléculas de oxígeno disuelto. El oxígeno, como todos los gases en la atmósfera, se disuelve en el agua hasta cierto grado. La concentración de oxígeno disuelto (OD) depende en gran medida de la temperatura, la presión y el nivel de salinidad del agua. La concentración máxima de OD a 1 atm y temperatura ambiente es de 8.26 mg/L para agua pura.

En los bioprocesos donde intervienen microorganismos aeróbicos, es muy importante mantener el nivel deseado de concentración de OD en el caldo de fermentación. Varios organismos necesitan niveles muy altos de oxígeno para la formación de productos relacionados con la biomasa. Esto requiere una medición continua de la concentración de OD en el biorreactor de tanque agitado y un sistema de control que reaccione rápidamente cuando haya una desviación de los valores diseñados según las necesidades de los microorganismos. Debido a que el número de microorganismos en el fermentador y su tasa metabólica cambian con el tiempo, el requerimiento de oxígeno del sistema tampoco permanece constante durante la fermentación.

La concentración de OD puede variar durante la fermentación como resultado de la actividad microbiana. Se han propuesto métodos físicos y químicos para la medición del kLa en bioreactores tanque agitados (STR). En los bioprocesos, los métodos de estado estacionario y no estacionario son los más preferidos. Estos métodos tienen ventajas superiores para varios casos según su aplicación.

La técnica de estado no estacionario (también conocida como dinámica) es el método más utilizado para medir la concentración de OD. Se basa en el monitoreo de la disminución de la concentración de OD con un electrodo de oxígeno al cortar el aire (oxígeno) que alimenta el biorreactor, y el aumento de la concentración de oxígeno al realimentar el aire (oxígeno). Básicamente, el nivel de OD se espumosa con nitrógeno o se reduce a cero añadiendo sulfuro de sodio. Luego, se sigue el aumento de la concentración de OD en función del tiempo.

El método de estado no estacionario consta de dos etapas: consumo y absorción. La aireación se detiene y el OD disminuye debido a la respiración celular durante la etapa de consumo. En la etapa de absorción, se reanuda la aireación y el OD aumenta hasta alcanzar un estado estacionario. A menudo es difícil obtener un kLa preciso utilizando el método de estado no estacionario. Porque, en primer lugar, las suposiciones sobre el grado de mezcla de la fase gaseosa deben elegirse correctamente. En segundo lugar, el tiempo de respuesta del electrodo debe ser rápido. Sin embargo, es comúnmente utilizado porque da un resultado más preciso.

Durante la transferencia de oxígeno del aire al agua, la resistencia real ocurre en la capa de la película líquida en la interfaz. Dentro del biorreactor donde no se consume oxígeno, cuando se desprecia la resistencia en la fase gaseosa, el cambio dependiente del tiempo de la concentración de OD viene dado por:

qOx​=kLa​(C∗−CL​)=OTR

donde:

  • kL​ es el coeficiente de transferencia de oxígeno (cm/h)
  • a es el área interfacial gas-líquido (cm²/cm³)
  • kLa​ es el coeficiente volumétrico de transferencia de masa (h⁻¹)
  • C∗ es la concentración de oxígeno disuelto saturado (mg/L)
  • CL​ es la concentración real de oxígeno disuelto en el caldo (mg/L)
  • qOx​ es la velocidad de transferencia de oxígeno (mg O₂ L⁻¹ h⁻¹)

El sistema en el STR no está en estado estacionario durante la reoxigenación. En este paso, la velocidad de cambio de la concentración de OD es igual a la velocidad de transferencia de oxígeno del gas al líquido. Si la velocidad de cambio de la concentración de OD con el tiempo es igual a cero y la concentración final de OD como valor estacionario es igual a CL​ (C∗=CL​), se podría obtener una expresión.

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miércoles, 21 de mayo de 2025

¿Qué son los Biorreactores?

Los biorreactores de tanque agitado son aparatos manufacturados que permiten la generación de un ambiente específico para el cultivo altamente controlado de células vivas.

Originalmente utilizados para sistemas de producción microbiana, han encontrado amplias aplicaciones en campos tan diversos como la producción de vacunas, el cultivo de células vegetales y el crecimiento de organoides cerebrales humanos, y existen en diseños igualmente diversos.

La fabricación de productos biológicos se realiza actualmente en su mayoría utilizando un biorreactor de tanque agitado y células huésped CHO, y representa el proceso de producción en biorreactor más "clásico".

La preparación y operación de un biorreactor (también conocido como proceso upstream en un entorno biotecnológico/industrial) se compone de tres pasos principales: expansión (generación de biomasa), producción (proceso por lotes, por lotes alimentados o continuo) y cosecha.

Expansión de las células en biorrectores

La expansión de las células puede durar desde unos pocos días hasta semanas, dependiendo del número de células al inicio, el tiempo de duplicación celular y la biomasa requerida para inocular el biorreactor de producción.

La fase de producción en biorreactores de tanque agitado dura unas pocas semanas y es una fase altamente sensible, ya que la concentración de diferentes químicos y los parámetros físicos deben ser estrictamente controlados.

Finalmente, la cosecha permitirá la separación del producto de interés de las partículas grandes y luego el material deseado (sobrenadante del cultivo celular o células) se transferirá al proceso downstream.

Las materias primas utilizadas durante la fase upstream (los tres pasos) deben estar alineadas con el propósito final del producto manufacturado, ya que la presencia de impurezas residuales puede tener un impacto en la idoneidad del producto final para el propósito deseado.

Para la producción de proteínas terapéuticas complejas como los anticuerpos recombinantes en biorreactores de tanque agitado, las líneas celulares de mamíferos han sido el caballo de batalla de la industria durante las últimas tres décadas.

Células de ovario de hámsper chino

Las células de ovario de hámster chino (CHO), en particular, han encontrado una amplia aplicación, ya que tienen un historial de uso seguro, exhiben una capacidad de crecimiento robusta con tiempos de duplicación razonables, pueden modificarse fácilmente para expresar transgenes de interés y sus productos muestran modificaciones post-traduccionales compatibles con el uso en humanos.

Actualmente se emplean diferentes modos de operación, desde sistemas de microportadores hasta diferentes variantes de procesos de perfusión.

Sin embargo, a pesar de un creciente interés en las tecnologías de perfusión en el cultivo de células de mamíferos, el cultivo clásico por lotes alimentados de líneas celulares en suspensión en biorreactores de tanque agitado es actualmente la técnica más utilizada, especialmente a mayor escala.

Como resultado, se han desarrollado una serie de soluciones "listas para usar" que van desde medios de cultivo celular optimizados hasta plataformas de expresión completas que proporcionan las células huésped, los consumibles necesarios y las recetas para el cultivo en biorreactores.

Utilizando estas tecnologías, las proteínas recombinantes secretadas pueden producirse con relativa facilidad en concentraciones volumétricas que oscilan desde cientos de miligramos por litro para proteínas difíciles de expresar hasta varios gramos por litro de medio de cultivo para proteínas fáciles de expresar, lo que hace que el enfoque sea atractivo tanto para la investigación pura como para el uso biotecnológico.

El flujo de trabajo para el cultivo celular en biorreactores generalmente comienza con la descongelación de las células que expresan una proteína recombinante de interés. La generación de tales poblaciones celulares se describe en otro lugar.

Los crioviales de las poblaciones celulares se congelan y se denominan banco celular.

Después de la descongelación del banco celular, las células se cultivan en recipientes de tamaño creciente, típicamente comenzando con pequeños matraces de agitación, con el objetivo de mantener las células en crecimiento logarítmico (el tren de siembra) hasta que estén disponibles en cantidades suficientes para inocular el/los biorreactor/es de producción.

Para reducir la heterogeneidad en la población celular, las células utilizadas para la fabricación de productos biológicos suelen ser de derivación clonal, lo que significa que una población celular se inició a partir de una sola célula.

Dicha población celular a menudo se denomina "clon", aunque existe una heterogeneidad significativa incluso en una población así.

Luego, las células se cultivan bajo condiciones estrictamente controladas durante 1 a 3 semanas con nutrientes añadidos en forma de alimentaciones, ya sea a intervalos predefinidos o basados en el consumo por parte de las células.

Los medios y alimentaciones libres de componentes de origen animal (generalmente abreviados ADCF o ADF) y químicamente definidos (generalmente abreviados CD) han reemplazado en gran medida a los medios anteriores que incluían suero bovino o de ternera o hidrolizados, ya que reducen el riesgo de introducción de patógenos, muestran una menor variabilidad entre lotes y simplifican la purificación y las pruebas posteriores.

En los últimos años, las tecnologías de un solo uso han encontrado una amplia aplicación tanto en la producción como en la investigación, ya que permiten omitir los pasos de limpieza y esterilización que requieren mucho tiempo y mano de obra, reducen el tiempo de respuesta del equipo y tienen como objetivo mejorar la reproducibilidad.

Es importante destacar que el riesgo de contaminación cruzada con material de un lote anterior se elimina por completo.

La operación general y el equipo requerido solo difieren en detalles menores entre los enfoques de un solo uso y los de múltiples usos.

Artículo completo Aquí ¿Qué son los Biorreactores?

lunes, 12 de mayo de 2025

Procesos en biorreactores

Usualmente, los biorreactores están integrados en plantas complejas, donde se utilizan tanto procesos upstream como downstream. Estos procesos en biorreactores muestran interacciones complejas y dinámicas entre las unidades de proceso.

Estas complejas dinámicas de proceso pueden tener una influencia significativa en la eficiencia de recursos y energía de una planta de producción biotecnológica completa.

El simulador de entrenamiento de una planta de bioetanol ha sido desarrollado para investigar la influencia de las estrategias de control de procesos y automatización en la eficiencia de recursos y energía de una planta de bioetanol.

El simulador consta de dos biorreactores: una unidad de filtración de flujo cruzado y una columna de destilación. Se utiliza S. cerevisiae como organismo productor de etanol. En el biorreactor 1 (B-8) se produce aeróbicamente el cultivo iniciador y luego se transfiere a un biorreactor 2 (B-17) operado anaeróbicamente para la producción de etanol.

Ambos biorreactores tienen un volumen de trabajo máximo de 15 l. La suspensión de etanol-levadura-agua se alimenta a una unidad de filtración de flujo cruzado (F-1), que se utiliza para reciclar la biomasa al biorreactor operado anaeróbicamente. La solución filtrada de etanol-agua se alimenta a una unidad de destilación a presión normal (C-1).

De esta unidad se obtienen dos corrientes. La corriente superior contiene principalmente etanol y la corriente inferior contiene principalmente agua más sustratos residuales y subproductos con baja presión de vapor. El simulador de planta de bioetanol puede operarse en modo discontinuo (batch), semicontinuo (fed-batch) y continuo.

Todos los modelos de procesos en biorreactores para los simuladores de las unidades de operación individuales han sido validados sobre la base de datos experimentales.

Como el simulador debería utilizarse para investigar el impacto de las estrategias de control de procesos en la eficiencia de recursos de la planta de bioetanol, el simulador tenía que ser capaz de describir el comportamiento dinámico de la planta completa, incluyendo la cinética de (bio)reacción, la cinética de transferencia de calor y masa, la dinámica de los procesos en biorreactores, la unidad de filtración de flujo cruzado o la columna de rectificación, así como el comportamiento dinámico de las válvulas, bombas, compresores, intercambiadores de calor, dispositivos de medición y otros elementos de la planta.

Además, se requería un modelo del sistema de automatización completo del proceso, que se realizó en dos niveles. Primero, los lazos de control PID requeridos se implementaron de manera similar a la planta real.

Segundo, la secuencia operativa para la operación de la planta se modeló utilizando GRAFCET (Graphe Fonctionnel de Commande Etapes/Transitions, IEC 60848, IEC 1131-3), que es un SFC y puede utilizarse para describir gráficamente cualquier secuencia operativa para un proceso.

El simulador de procesos en biorreactores de planta de bioetanol brevemente descrito se aplicó para realizar estudios sobre el impacto de diferentes estrategias operativas en la eficiencia de recursos de la planta. Se utilizaron planes GRAFCET con diferentes conjuntos de valores de parámetros para realizar diferentes procedimientos operativos.

Como resultado, los autores concluyen que las estrategias y condiciones operativas para el proceso global pueden llevar a una variación de las demandas de energía para la producción de etanol del 48%.

Este ejemplo ilustra la importancia de una capacitación bien realizada de los operadores de planta, ya que sus decisiones con respecto a los procedimientos operativos pueden tener un impacto importante en los rendimientos del producto, así como en la operación eficiente en recursos y energía de plantas biotecnológicas y biorreactores complejos.

Los procesos industriales con biorreactores exhiben un comportamiento dinámico complejo. Esto genera altas demandas en las habilidades operativas de los operadores de planta. También en la investigación, los experimentos de cultivo en biorreactores a escala piloto son de creciente complejidad dinámica, lo que requiere muy buenas habilidades operativas del personal de investigación y los estudiantes.

La alta interdependencia de subprocesos biológicos, químicos, físicos y técnicos complejos dificulta la educación y capacitación de operadores y técnicos, así como de estudiantes de ingeniería bioquímica, para la operación y el análisis de procesos en biorreactores eficientes de los bioprocesos.

embargo, varios estudios demuestran que los simuladores de entrenamiento ofrecen una herramienta interesante para mejorar eficazmente las habilidades operativas de operadores de planta, técnicos, ingenieros y estudiantes de ingeniería y tecnología bioquímica, lo que a su vez puede conducir a una reducción significativa de los costos de producción.

Además, los simuladores de entrenamiento pueden utilizarse como sistemas de prueba de control digital y apoyar el desarrollo de sistemas de control, así como el desarrollo de nuevas estrategias de operación automatizada y control avanzado.

A pesar de su complejidad, el modelado exitoso de bioprocesos ha sido demostrado por científicos durante muchos años y los modelos ahora forman una base de conocimiento muy poderosa para estos procesos.

Las potentes computadoras personales, las herramientas de simulación y las estrategias de modelado en combinación con una gestión de proyectos eficiente hacen posible utilizar estos modelos como base para los simuladores de entrenamiento.

Sin embargo, dado que el modelado es un factor de costo importante en el desarrollo de simuladores de entrenamiento, se recomienda crear bibliotecas de modelos y facilitar el uso múltiple de modelos de procesos matemáticos.

Fuente original Aquí Procesos en biorreactores

lunes, 5 de mayo de 2025

Biorreactores de digestión anaeróbica

Los biorreactores de digestión anaeróbica suelen ser bastante grandes con volúmenes de hasta 20000 m³. A diferencia de otros bioprocesos, en la digestión anaeróbica, una población de diferentes organismos necesita interactuar para hidrolizar los sustratos básicamente indefinidos y formar biogás, una mezcla de gases que contiene principalmente metano y dióxido de carbono.

En el reactor tienen lugar complejos procesos biológicos, químicos y físicos que están influenciados por estrategias de control de procesos adecuadas. Un desafío para el desarrollo de simuladores de entrenamiento es la combinación de los procesos biológicos, que son bastante lentos, con los procesos técnicos, que son rápidos.

El simulador de entrenamiento de biogás es un buen ejemplo de simulador de entrenamiento multipropósito. Se desarrolló como un probador de sistemas de control digital (DCS-tester) para apoyar la construcción y prueba de lazos de control y un sistema de control de procesos para una planta de biogás de laboratorio.

Los biorreactores de digestión anaeróbica se utilizaron para desarrollar nuevas estrategias de control e investigar la interdependencia de los efectos biológicos/fisicoquímicos con los efectos técnicos dentro de un proyecto de investigación.

A partir de esta especificación, se dedujeron las exigencias para el modelo matemático del proceso. El modelo tenía que ser capaz de simular procesos de digestión anaeróbica de diversos sustratos en modo discontinuo (batch), semicontinuo (fed batch) y continuo con una precisión adecuada, manteniendo el balance de masa.

Las variables de estado modeladas debían incluir las concentraciones de metano y dióxido de carbono, la tasa de producción de biogás, el pH, la temperatura en el reactor/medio y la presión en el espacio de cabeza del reactor. Además de los procesos biológicos en biorreactores de digestión anaeróbica, bioquímicos y fisicoquímicos relevantes, se tuvo que modelar la dinámica de los sensores y actuadores para permitir el desarrollo del controlador.

Como el proceso de biogás es muy lento, se tuvo que implementar un modo de simulación acelerado 200 veces. El cálculo del modelo tenía que ser posible en sistemas PC convencionales, manteniendo la estabilidad numérica y una alta velocidad de cálculo.

Además, este simulador de entrenamiento se basa en cuatro submodelos interactivos que describen los subsistemas biológico, fisicoquímico, del reactor y de la planta del proceso global. Los biorreactores de digestión anaeróbica se adaptaron para simular un reactor de laboratorio de 10 litros que procesaba tres sustratos bien definidos diferentes, así como mezclas variables de estos compuestos.

Los submodelos biológico y fisicoquímico se implementaron en el lenguaje de programación FORTRAN; los submodelos del reactor y de la planta se implementaron directamente en un programa industrial de control de procesos y simulación. Los submodelos combinados se conectaron a varios lazos de control, automatizaciones, sistemas de adquisición de datos e interfaces gráficas de usuario.

El submodelo biológico se basa en un modelo descrito por Bernard et al. y se adaptó para procesar mezclas complejas de sustratos de carbohidratos, proteínas y lípidos, que son degradados por bacterias acidogénicas para producir ácidos grasos volátiles (AGV) y generar subproductos como dióxido de carbono y nueva biomasa. Los AGV son posteriormente degradados por bacterias metanogénicas para formar metano (CH4), dióxido de carbono (CO2) y nueva biomasa.

Se utilizaron cinéticas de tipo Monod para modelar las tasas de captación de sustrato en función de las concentraciones de sustrato o intermediarios. Además, se implementaron funciones que describen la inhibición del proceso biológico debido a temperaturas, pH y concentración de AGV subóptimos.

El submodelo fisicoquímico describe el pH en el medio de reacción, el fraccionamiento del carbono inorgánico total (CIT) en bicarbonato (HCO3−), ácido carbónico (CO32−) y dióxido de carbono (CO2), las presiones parciales de dióxido de carbono y metano en la fase líquida y los flujos de masa de estos gases hacia el espacio de cabeza del reactor. El pH está influenciado por algunos de los componentes iniciales del sustrato (es decir, proteínas), los AGV y los flujos de ácido y álcali de entrada para permitir el control del pH.

El modelo ideal de reactor de tanque agitado básicamente comprende un sistema de 13 ecuaciones diferenciales no lineales que modelan las concentraciones de biomasa, sustrato y producto dentro del caldo de cultivo. Su estructura es similar a la del simulador de entrenamiento de biorreactores.

El submodelo de la planta comprende todos los componentes de la planta. El modelo de la planta se puede adaptar para simular diferentes configuraciones de planta. Los agregados modelados incluyen válvulas, bombas, tanques, conductos y sensores. La dinámica de los actuadores e instrumentos se modeló con precisión para permitir el diseño de lazos de control y automatizaciones. Se añadió ruido de medición a las variables de estado calculadas.

El simulador de entrenamiento se aplicó para el desarrollo y prueba de controladores básicos y funciones del sistema de control, el desarrollo de nuevos esquemas de control de lógica difusa para reactores de biogás, la investigación de la influencia de los aspectos técnicos en las señales de medición utilizadas para el análisis y control de procesos y, finalmente, para la formación y educación universitaria.

Se informó que los lazos de control importantes, por ejemplo, para nivel, temperatura y pH, pudieron diseñarse y probarse adecuadamente con el simulador y luego se aplicaron en una planta de laboratorio real. Además, se desarrolló con éxito una estrategia compleja de alimentación de sustrato con el simulador, evitando los efectos inhibidores, típicos de los procesos de biogás.

La simulación acelerada, en biorreactores de digestión anaeróbica, 200 veces demostró ser muy útil no solo en la formación y educación de los estudiantes, sino también para el desarrollo de un controlador de lógica difusa, ya que la parametrización del controlador requirió un número bastante elevado de experimentos de simulación.

Un beneficio adicional del simulador surgió del análisis de la dinámica de las mediciones del proceso con respecto a las influencias biológicas y técnicas. Este análisis ilustró la sensibilidad de la precisión y la dinámica de las mediciones de los gases de escape a las tasas de flujo de gas y los efectos de dilución, y por lo tanto contribuyó a mejorar la configuración de la planta piloto.

Más información Aquí Biorreactores de digestión anaeróbica

sábado, 12 de abril de 2025

El primer Simulador de Entrenamiento en Biorreactores

El primer simulador de entrenamiento en biorreactores fue publicado por primera vez por Hass, utilizando como ejemplos el cultivo de levadura de panadero y la fermentación etanólica. Este simulador fue luego desarrollado aún más por Gerlach y otros para describir la producción de proteínas recombinantes con *E. coli*. Una derivación del simulador fue desarrollada por Hass y Pörtner y fue incluida en un libro de texto dirigido a ingenieros en bioprocesos y biotecnólogos.

Los grupos objetivo para el simulador de entrenamiento en biorreactores son técnicos e ingenieros, así como estudiantes de biotecnología, ingeniería bioquímica y campos relacionados. Los objetivos del entrenamiento con este simulador son apoyar la enseñanza de los fundamentos de la ingeniería bioquímica y, principalmente, proporcionar capacitación industrial y académica para la operación de entrenamiento en biorreactores de tanque de acero agitado mediante sistemas modernos de control de procesos; también busca ofrecer formación para la realización de experimentos reales de cultivo y la planificación de estrategias operativas para biorreactores. El simulador de entrenamiento fue diseñado para capacitar en el arranque de biorreactores, así como en las operaciones por lotes, alimentación continua y funcionamiento continuo. Finalmente, puede ser utilizado en la capacitación de ajuste de controladores para los lazos de control de biorreactores.

La levadura *S. cerevisiae* presenta características metabólicas que son particularmente adecuadas para demostrar la interdependencia entre el metabolismo microbiano, las estrategias operativas del entrenamiento en biorreactores y el rendimiento general del proceso. El proceso de cultivo es relevante a nivel industrial y también puede llevarse a cabo en laboratorios universitarios y prácticas. La levadura obtiene su energía para crecer metabolizando glucosa tanto en condiciones aeróbicas (respiración) como anaeróbicas (fermentación).

Durante la fermentación anaeróbica, *S. cerevisiae* produce dióxido de carbono y etanol como productos de la glucólisis. Bajo condiciones aeróbicas, el etanol puede utilizarse como sustrato si no hay glucosa disponible (crecimiento diauxico). De particular interés para la operación y control del proceso está el efecto Crabtree. *S. cerevisiae* produce etanol incluso bajo condiciones aeróbicas si hay más glucosa disponible de la que puede metabolizarse a través de la cadena respiratoria. Además, el producto etanol muestra efectos inhibitorios.

A partir de las propiedades biológicas del organismo, pueden deducirse estrategias operativas. Para maximizar el rendimiento de biomasa a partir del sustrato de carbono y producir una concentración máxima de biomasa, debe aplicarse una estrategia de alimentación por lotes continuos o semicontinuos (fed-batch), manteniendo la concentración de glucosa baja. Al mismo tiempo, la estrategia de burbujeo y agitación debe asegurar niveles suficientes de oxígeno en el caldo de cultivo; el pH y la temperatura deben ajustarse y controlarse en condiciones óptimas para el crecimiento. La dinámica general del proceso requiere controladores bien ajustados en una amplia gama de condiciones operativas.

Cepas genéticamente modificadas de *E. coli* se utilizan para producir proteínas recombinantes, como la proteína verde fluorescente (GFP). Gerlach y otros extendieron el simulador de entrenamiento en biorreactores con un modelo para la producción de GFP utilizando *E. coli*. La producción de GFP se induce mediante la adición de isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a concentraciones específicas de biomasa. Durante el cultivo aeróbico, *E. coli* produce varios ácidos orgánicos, que pueden mostrar efectos inhibitorios sobre el crecimiento a ciertas concentraciones elevadas.

Este proceso también es relevante a nivel industrial y puede realizarse en laboratorios universitarios. Aquí, pueden investigarse estrategias de alimentación e inducción con respecto al rendimiento de GFP, y entrenarse el monitoreo y control de un proceso bastante complejo utilizando datos en línea y fuera de línea.

Ambos organismos se cultivan en un biorreactor de tanque de acero agitado de 20 L (acero inoxidable). El reactor está equipado con tanques de alimentación, ácido, base, antiespumante y producto, así como con las bombas correspondientes. El suministro de oxígeno se realiza a través de una estación de mezcla de gases (aire, oxígeno, nitrógeno), donde se pueden ajustar las tasas de gaseificación. El control de temperatura se logra mediante una camisa de calentamiento. El recipiente está equipado con sondas para medir la temperatura, el pH, el oxígeno disuelto y el nivel de espuma. Las balanzas indican los cambios de masa dentro de los tanques y del biorreactor.

Se pueden tomar muestras a través de una válvula de muestreo para el análisis fuera de línea de las concentraciones de sustrato y producto. Los controladores PID están disponibles para la temperatura, el pH y el nivel. El control PID del oxígeno disuelto se realizó en forma de cascada (velocidad del agitador, flujo de aire, flujo de oxígeno). La operación del biorreactor se lleva a cabo a través de una interfaz gráfica de usuario del sistema de control de procesos. El biorreactor puede operar en modo por lotes, alimentación continua (fed-batch) o continuo.

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