Biorreactores: Un Impulso a la Medicina Regenerativa para la Producción Masiva de Cardiomiocitos

Las enfermedades del corazón constituyen una de las principales causas de fallecimiento a nivel global, un desafío de salud que clama por soluciones innovadoras. El corazón, un órgano vital incapaz de sanar su propio tejido de forma eficaz, deja a los pacientes con opciones limitadas. En casos severos, el trasplante cardíaco es la única alternativa curativa. No obstante, la escasez de donantes ha generado una disparidad crítica entre la demanda y la oferta, lo que subraya la urgencia de hallar tratamientos alternativos que sean escalables y eficientes. Es aquí donde la medicina regenerativa y la tecnología de los biorreactores emergen como un rayo de esperanza para millones de personas.

El Potencial de las Células Madre Pluripotentes Inducidas (hiPSCs)

Las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) son el pilar de esta nueva era médica. Se distinguen por su excepcional capacidad de multiplicación y por su aptitud para transformarse en diversos tipos celulares, entre ellos los cardiomiocitos (CM). Estos cardiomiocitos, obtenidos a partir de células madre, poseen el potencial de reemplazar el tejido cardíaco dañado, restaurando así la funcionalidad del corazón. Sin embargo, para que esta terapia se convierta en una opción viable y esté al alcance de un gran número de pacientes, es indispensable la producción de grandes volúmenes de cardiomiocitos de alta pureza.

El principal obstáculo radica en optimizar el proceso de diferenciación de las hiPSCs hacia cardiomiocitos, garantizando su eficiencia y escalabilidad. A pesar de que las hiPSCs representan una fuente celular renovable, su manipulación en el laboratorio exige metodologías avanzadas que permitan un cultivo a gran escala y una diferenciación controlada. Esto nos conduce directamente a la necesidad de implementar sistemas sofisticados de cultivo celular, como los que ofrecen los biorreactores.

El Salto a la Producción a Gran Escala: Del Laboratorio al Biorreactor

Tradicionalmente, el cultivo de células madre se ha llevado a cabo en placas de laboratorio. Aunque este método es adecuado para la investigación en pequeña escala, resulta inviable para la producción de las enormes cantidades de células requeridas en aplicaciones clínicas. Es en este punto donde los microcarriers y los biorreactores con agitación (spinner cultures) se revelan como herramientas esenciales.

Los microcarriers son diminutas esferas a las que las células pueden adherirse y proliferar. Su uso en un biorreactor de tipo agitado permite mantener las células en suspensión en un medio de cultivo, lo cual maximiza la superficie de crecimiento disponible y posibilita una producción sustancialmente mayor que la que se obtendría en placas estáticas. La agitación regulada del biorreactor asegura una distribución homogénea tanto de las células como de los microcarriers, facilitando que todas reciban los nutrientes necesarios y que se eliminen los desechos metabólicos. Este sistema integrado de proliferación y diferenciación es crucial para materializar la visión de una fuente constante y escalable de cardiomiocitos maduros.

Un Enfoque Bifásico para la Optimización y Selección

Para asegurar el éxito de la producción, es fundamental seguir un procedimiento de dos fases para seleccionar las líneas celulares más adecuadas. La primera fase implica la evaluación del potencial de diferenciación cardíaca de las hiPSCs en cultivos de monocapa. No todas las líneas celulares se diferencian con la misma eficacia, por lo que es vital identificar aquellas con la mayor capacidad para generar cardiomiocitos. Este cribado inicial permite descartar las líneas menos prometedoras y concentrar los esfuerzos en las que poseen las características óptimas.

La segunda fase se centra en la capacidad de proliferación de estas líneas celulares previamente seleccionadas en cultivos con microcarriers dentro de un biorreactor. Una vez que se ha verificado que una línea celular puede diferenciarse de manera efectiva, es necesario confirmar que también puede crecer rápidamente en el ambiente del biorreactor con microcarriers. Esta habilidad de crecimiento a gran escala es tan importante como la capacidad de diferenciación. Únicamente las líneas celulares que demuestran un alto potencial en ambos aspectos son consideradas candidatas ideales para la producción masiva.

Un Protocolo Detallado para la Diferenciación en Biorreactores

El protocolo para la diferenciación de hiPSCs en cardiomiocitos es un proceso meticuloso que se realiza bajo condiciones estériles y controladas, usualmente en una cabina de bioseguridad. El proceso de diferenciación comienza cuando las hiPSCs, cultivadas en placas o en biorreactores sobre microcarriers, alcanzan una confluencia del 95-100%.

Se lleva a cabo un cribado inicial para determinar la concentración más efectiva del compuesto CHIR (un modulador de la vía de señalización Wnt) para cada línea celular, ya que su sensibilidad puede variar. Este paso es esencial para una diferenciación eficiente. Una vez establecida la concentración óptima, el protocolo de diferenciación generalmente sigue una secuencia de pasos:

• Día 0: Las células confluentes son expuestas a un medio de diferenciación basal que contiene la concentración óptima de CHIR durante 24 horas.
• Día 1: Tras 24 horas, el medio se cambia y las células se incuban por 24 horas adicionales.
• Día 2: El medio se sustituye por uno que contiene el compuesto IWR-1, un inhibidor de la vía Wnt, que contrarresta el efecto del CHIR y potencia la diferenciación cardíaca. Esta etapa se prolonga durante 48 horas.
• Día 4 en adelante: A partir de este momento, se realizan cambios de medio diariamente con medio fresco hasta el día 14.

Hacia el día 14, las células madre pluripotentes ya diferenciadas pueden ser disgregadas y analizadas mediante técnicas como la citometría de flujo, para verificar la pureza y la identidad de los cardiomiocitos generados. Este enfoque integrado, que va desde la selección de la línea celular hasta una diferenciación rigurosamente controlada, representa un avance significativo hacia la producción de cardiomiocitos en una escala que podría satisfacer las demandas terapéuticas.

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Biorreactores y la promesa de las células madre para regenerar el corazón.

Las enfermedades cardíacas son una de las principales causas de muerte en todo el mundo. Cuando un corazón se daña, por ejemplo, después de un ataque, sus células musculares, llamadas cardiomiocitos, no pueden regenerarse por sí solas. La única solución hasta ahora ha sido el trasplante de corazón, pero la escasez de donantes es un obstáculo enorme.

La ciencia detrás de la solución: Células madre pluripotentes en biorreactores para regenerar el corazón

Biorreactores para regenerar el corazón  - Aquí es donde entra en juego la ciencia de los biorreactores y de las células madre pluripotentes inducidas (conocidas como iPSCs por sus siglas en inglés). Estas células son extraordinarias: tienen una gran capacidad de proliferación y, lo que es aún más importante, pueden transformarse en casi cualquier tipo de célula del cuerpo, incluidos los cardiomiocitos funcionales.

El objetivo es aprovechar estas propiedades para crear un suministro ilimitado de cardiomiocitos sanos que puedan usarse para reparar el tejido cardíaco dañado. Sin embargo, para que esta terapia sea viable a gran escala, necesitamos una forma eficiente y masiva de producir estas células.

El desafío de la producción en masa en biorreactores para regenerar el corazón: Del laboratorio a la terapia

No todas las líneas de células madre se comportan de la misma manera. Algunas tienen un mayor potencial para convertirse en cardiomiocitos que otras, y sus tasas de crecimiento también pueden variar. Por ello, el primer paso en nuestro protocolo es la selección de las mejores líneas celulares.

Una vez identificadas, el siguiente desafío es cómo cultivarlas en grandes cantidades. Aquí es donde los microportadores (microcarriers) juegan un papel clave. Son pequeñas esferas sobre las que las células pueden crecer, permitiendo que se cultiven miles de millones de células en un solo biorreactor. Este sistema, en particular, se utiliza en cultivos en agitadores (spinner culture), lo que permite una producción a una escala mucho mayor que la de las placas de cultivo tradicionales.

Un enfoque integrado para la producción

Nuestro método combina estos dos pasos:

1. Evaluación inicial: Se evalúa el potencial de diferenciación cardíaca de varias líneas de células madre en un cultivo convencional para seleccionar las más prometedoras.
2. Producción optimizada: Las líneas seleccionadas se cultivan en grandes cantidades utilizando microportadores en biorreactores, para luego inducir su diferenciación en cardiomiocitos.

Este enfoque integrado nos permite superar el reto de la producción, allanando el camino para que los cardiomiocitos derivados de células madre se conviertan en una fuente terapéutica escalable para tratar enfermedades cardíacas.

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Biorreactores y Materiales y equipos clave para el proceso

Para quienes estén interesados en los detalles técnicos, aquí se listan algunos de los equipos y reactivos esenciales para llevar a cabo este protocolo.

Equipamiento mínimo:

• Gabinete de bioseguridad: Para un entorno estéril.
• Incubadoras de CO2: Para mantener las condiciones ideales de cultivo.
• Biorreactores tipo spinner: Vasos de cultivo con agitador magnético para la producción en microportadores.
• Microscopio de contraste de fases: Para observar el crecimiento celular.
• Citómetro de flujo: Para analizar las características de las células, como su pureza.

Medios y reactivos:

• mTeSR™1: Un medio de cultivo específico para mantener la pluripotencia de las células madre.
• Medios específicos para diferenciación: Como RPMI-1640 y B27 sin insulina.
• Pequeñas moléculas: Como CHIR99021 e IWR1, que se utilizan para guiar la diferenciación de las células madre hacia cardiomiocitos.
• Microportadores: Las pequeñas esferas donde las células crecen en grandes cantidades.

Con cada avance en este campo, nos acercamos un poco más a la visión de tener una fuente renovable y segura de células cardíacas, listas para restaurar la función del corazón y salvar vidas.

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Inducción de Células Progenitoras Hematopoyéticas e Inmunotinción

Para una mayor inducción de células progenitoras hematopoyéticas, las células se cultivan en medio para células progenitoras hematopoyéticas durante otros 3 a 5 días.

Apague el sistema de control electrónico en los biorreactores y retire con cuidado los frascos T12.5 del rotador de accionamiento biaxial.

Aspire el medio de diferenciación de células progenitoras del endotelio hemogénico y añada unos 30 mL de medio para células progenitoras hematopoyéticas en los frascos T12.5 del grupo RPM.

Coloque los frascos T12.5 en el rotador de accionamiento biaxial y vuélvalos a introducir en la incubadora de CO2 durante 3 días más de cultivo celular.

Cambie el medio con medio fresco para células progenitoras hematopoyéticas de medio volumen cada dos días.

Después de 3 días de cultivo en medio para células progenitoras hematopoyéticas, se forman muchos cúmulos con forma de uva y muchas células redondas flotan en el medio. Las células progenitoras hematopoyéticas diferenciadas se caracterizan por los marcadores de superficie CD34 y CD43.

En el día 2, 5 y 8 del cultivo, las células diferenciadas en los frascos bajo diferentes condiciones de cultivo se recogen y se preparan para la inmunotinción.

Retire el medio de los frascos y añada PBS a las células para lavarlas 1 o 2 veces.

Aspire el PBS y luego fije con una solución de paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos.

Lave las células una vez con PBS y la base de los frascos se divide en pequeños trozos (de 1 cm x 1 cm) con cuchillas afiladas.

Coloque cada pequeño trozo que contenga células en un plato de cultivo celular de 24 pocillos y añada PBS al pocillo.

Permeabilice las células durante 20 minutos con Triton X-100 al 0.2% y suero de burro al 1% a temperatura ambiente (ver Nota 7).

Lave las células dos veces con PBS y añada la solución bloqueante de suero de burro al 5% al pocillo para un bloqueo de 1 hora a 37 °C.

Prepare el anticuerpo primario en suero de burro al 5% en las diluciones recomendadas por el fabricante.

Incube las células en la solución de anticuerpo primario durante toda la noche a 4 °C (o 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos conjugados con colorantes fluorescentes).

Lave las células tres veces con PBS para reducir el fondo fluorescente.

Prepare la solución mezclada que contiene el segundo anticuerpo (diluciones 1:200) y Hoechst 33342 (0.1–1 μg/mL) en PBS con suero de burro al 5%.

Incube las células en la solución mezclada durante 1 hora a temperatura ambiente.

Lave las células dos veces durante 5 minutos en PBS.

Ponga una gota de medio de montaje, añada un cubreobjetos y selle con esmalte de uñas.

Observe las láminas y adquiera la imagen bajo el microscopio confocal.

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Preparación para Inmunotinción (Días 5 y 8)

En el día 5 y 8 del cultivo, las células diferenciadas en los frascos bajo diferentes condiciones de cultivo se recolectan y se preparan para la inmunotinción.

Disocie las células en células individuales con tripsina al 0.05% y EDTA al 0.1%.

Añada solución inhibidora de tripsina y centrifuge durante 5 minutos a 500 g y 4 °C y deseche el sobrenadante.

Lave las células con tampón de lavado celular (PBS que contiene BSA al 5%).

Cuente las células y resuspéndalas en BSA al 5% en PBS a 1×106 células/mL.

Transfiera 50 μL de suspensión celular a tubos de ensayo.

Añada los anticuerpos primarios purificados y conjugados con fluorescencia diluidos (CD31, CD34 y CD43) a los tubos de ensayo en las diluciones recomendadas por el fabricante. Los controles incluyen: negativo (sin tinción añadida), control de isotipo (con anticuerpo primario no específico etiquetado de manera similar).

Incube en hielo durante 30 minutos en la oscuridad.

Lave cada muestra tres veces con 2 mL de tampón de lavado celular, centrifugue a 500 g durante 5 minutos a 4 °C.

Añada 500 μL de PBS a cada pellet y resuspenda la muestra celular.

Examine las muestras celulares usando el citómetro de flujo FACS Calibur (BD).

Analice los datos con el software FlowJo, versión 10.0.7.

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Notas Adicionales

Si no se va a usar inmediatamente, la placa de cultivo recubierta debe sellarse con parafilm para evitar la evaporación de la solución de Matrigel® y las placas se pueden almacenar a 2–8 °C hasta por 1 semana después del recubrimiento.

Cuando la disociación celular dure aproximadamente 2 minutos en la incubadora, debe verificar el estado de las células para asegurarse de que las colonias estén sueltas y se desprendan del fondo del plato o frasco. No digiera en exceso las células para generar una suspensión de células individuales.

Resuspenda suavemente el pellet celular con una pipeta para evitar generar una suspensión de células individuales. El tamaño de los agregados celulares se puede ajustar alterando el número de veces que la mezcla de agregados celulares se pipetea hacia arriba y hacia abajo. Tenga cuidado de mantener las células como agregados.

Siembre los agregados celulares a una densidad óptima en el frasco (aproximadamente 100 agregados/cm²). No siembre demasiado denso ni demasiado disperso.

El frasco debe llenarse con un medio de cultivo celular y asegúrese de que la burbuja se extraiga en el grupo RPM.

La alimentación del sistema de control electrónico debe apagarse al preparar el cambio del medio celular.

Este paso se puede omitir cuando se tiñen las células con anticuerpos CD31, CD34 o CD43.

Más información Aquí Inducción de Células Progenitoras Hematopoyéticas e Inmunotinción

Expansión de Células Madre Pluripotentes Humanas sin Células Alimentadoras

En cuanto a las Células Madre Pluripotentes Humanas, antes de la diferenciación de las células madre embrionarias humanas (CEEh), las CEEh no diferenciadas y dependientes de alimentadoras se cultivan en condiciones libres de alimentadoras y químicamente definidas con el uso del medio TeSR™-E8™ en placas recubiertas con Matrigel Matrix HESC-qualified (Bio-Coat). Podemos omitir este paso si las CEEh se mantienen en medio TeSR™-E8™. Las siguientes instrucciones son las que se utilizan en los experimentos.

Antes de descongelar o pasar las CEEh, recubrir una nueva placa de 6 pocillos con una solución de Matrigel Matrix, y preincubar a temperatura ambiente (25 °C) durante al menos 1 h antes de usar.

• Retirar la solución de Matrigel Matrix con una pipeta o por aspiración.
• Añadir 2 mL de medio TeSR™-E8™ a la placa de 6 pocillos.
• Colocar la mezcla de agregados celulares pequeños (500–1000 agregados/pocillo) en la placa de 6 pocillos que contiene TeSR™-E8™ y observar el estado de los agregados celulares bajo el microscopio para asegurar la densidad celular deseada.
• Colocar la placa de 6 pocillos en una incubadora de CO₂ a 37 °C. Mover la placa con movimientos hacia adelante y atrás y de lado a lado para distribuir uniformemente los pequeños agregados celulares.
• Cambiar el medio diariamente con TeSR™-E8™ y monitorear el crecimiento celular a diario hasta el siguiente pasaje o la diferenciación celular.

Antes de la inducción del mesodermo, recubrir cada matraz T12.5 con 1.5 mL de Corning Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix diluido a temperatura ambiente durante 30 min y luego incubar los matraces a 37 °C durante otros 30 min.

• En el momento del pasaje celular, digerir las colonias de células  de células madre pluripotentes humanas (CPHh) en pequeños agregados celulares con ReLeSR™ a 37 °C durante unos 3 min.

• Detener la digestión con TeSR™-E8™ en el biorreactor, golpear suavemente la placa de cultivo para asegurarse de que los pequeños agregados celulares se desprendan del fondo de la placa.
• Recolectar los agregados celulares en un tubo de centrífuga de 15 mL y pipetear la suspensión de agregados celulares suavemente hacia arriba y hacia abajo unas 3–5 veces para ajustar el tamaño de los agregados a 100–200 células/agregado.
• Centrifugar los agregados recolectados a 500 rpm durante 5 min a temperatura ambiente, retirar el sobrenadante del tubo de centrífuga de 15 mL y resuspender los pequeños agregados celulares en 2 mL de TeSR™-E8™.

• Retirar el líquido de los matraces T12.5 recubiertos con Corning y añadir 2 mL de TeSR™-E8™ al matraz.
• Sembrar los agregados celulares en el matraz T12.5 recubierto con Matrigel de Corning a una densidad de aproximadamente 100 agregados/cm2 en TeSR™-E8™.
• Colocar los matraces en la incubadora de CO₂ (37 °C, 5% de CO2​ y 95% de humedad) y agitar los matraces con varios movimientos rápidos de lado a lado y de adelante hacia atrás para distribuir uniformemente los agregados.
• Verificar el estado de crecimiento de las colonias celulares al segundo día; si el tamaño de las colonias supera los 300 μm, deberían estar listas para ser cambiadas al medio de diferenciación.
• Aspirar el medio del matraz T12.5 y añadir 5 mL de medio de inducción del mesodermo, colocar los matraces en una incubadora para cultivar durante 2 días.
• Después de 2 días de cultivo en medio de inducción del mesodermo, hemos observado que casi todas las colonias exhiben una apariencia de colonia suelta y una morfología celular alargada, y dan lugar a células diferenciadas Brachyury.

Después de 2 días de inducción del mesodermo, las células de células madre prrrrrrrrr pluripotentes se cultivan adicionalmente cambiando al medio de diferenciación de células progenitoras de endotelio hemogénico. Algunos de los matraces T12.5 con células inducidas a mesodermo se colocan en el rotador de accionamiento biaxial. Los matraces T12.5 y el rotador de accionamiento biaxial se colocan en la incubadora de CO₂ para el cultivo celular.

• Aspirar el medio de inducción del mesodermo y añadir 30 mL de medio de diferenciación de células progenitoras de endotelio hemogénico a los matraces T12.5 del grupo RPM y añadir 5 mL de medio a los matraces T12.5 del grupo de control (ver Nota 5).
• Poner los matraces T12.5 del grupo RPM en el rotador de accionamiento biaxial.
• Colocar el rotador de accionamiento biaxial con los matraces T12.5 y los matraces T12.5 del grupo de control en la incubadora de CO₂ a 37 °C con 5% de CO2​ y 95% de humedad para la inoculación y cultivo celular.
• Encender el sistema de control electrónico y configurarlo en modelos de velocidad aleatoria (0.1–10 rpm).
• Cambiar la mitad del volumen del medio por medio fresco de diferenciación de células progenitoras de endotelio hemogénico cada dos días.
• Después de 3 días de cultivo de células madre pluripotentes en medio de diferenciación de células progenitoras de endotelio hemogénico, en el grupo RPM surgieron células con morfología endotelial y estructuras tubulares. Algunas células diferenciadas contenían células redondas con cúmulos "en forma de uva". Las células diferenciadas se caracterizan por los marcadores de superficie CD31 y CD34.

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Biorreactores de Volumen de Nanolitros para el Cultivo Celular

Los biorreactores de volumen de nanolíticos para la frabricación de dispositivos microfluídicos consisten en microcanales grabados o estampados en sustratos hechos de polímero, vidrio o silicio. Las intrincadas conexiones de los microcanales a biorreactores con algunas estructuras mecánicas inteligentes como trampas o curvaturas cumplen las funcionalidades deseadas, como la mezcla, la separación, el control del flujo o el establecimiento del entorno para las reacciones bioquímicas. Aquí, describimos los métodos de fabricación de un microbioreactor termoplástico paso a paso. Primero, se realiza la selección del material; luego, se determinan los métodos de producción con el equipo que se puede adquirir fácilmente en un laboratorio. Se eligió COP (polímero de olefina cíclica) por sus características sobresalientes entre muchos polímeros. Se diseñan dos tipos de biorreactores de volumen, con y sin electrodos, utilizando los programas AutoCAD y L-edit. Se emplean la fotolitografía y el grabado electroquímico húmedo para la preparación del molde maestro. Se utiliza un evaporador térmico para la deposición de cromo puro y oro sobre el sustrato de COP, y se usan grabadores para formar los electrodos interdigitados. Una vez producido el molde maestro, se utiliza el termoestampado para obtener la forma diseñada en el COP perforado y planarizado. La cubierta de COP, con o sin electrodos, se une al COP termoestampado mediante termocompresión, y se realiza el dispositivo microfluídico termoplástico. Se conectan tubos al dispositivo y se establece un puente entre el macromundo y el micromundo. Células de levadura o de mamíferos marcadas o etiquetadas con GFP/RFP en productos genéticos específicos se cargan en el dispositivo microfluídico, y se recopilan datos en tiempo real sobre las dimensiones celulares y la intensidad de fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia invertido; finalmente, se utiliza el procesamiento de imágenes para analizar los datos adquiridos.

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El éxito sin precedentes de la industria microelectrónica en la integración de dispositivos de biorreactores de volumen de tamaño micro y nano a muy altas densidades utilizando métodos de fabricación como la litografía, la deposición de películas delgadas y el grabado, allanó el camino para el desarrollo de plataformas microfluídicas. La fuerza impulsora de estas tecnologías siempre ha sido miniaturizar los sistemas de análisis bioquímicos de tamaño de escritorio. La principal ventaja de la miniaturización en estos sistemas es la reducción del volumen de la muestra y del reactivo. Los dispositivos microfluídicos también proporcionan una transferencia de calor más rápida, tiempos de proceso más cortos y una mejor automatización. Las aplicaciones biológicas y médicas en el cultivo celular, la detección de fármacos y los sistemas de punto de atención (POC) adoptan la tecnología microfluídica debido a la integración de varios pasos en plataformas únicas automatizadas, lo que las convierte en plataformas potentes para estudios de células individuales. El cultivo, la separación/aislamiento, la detección y el análisis de células individuales se pueden realizar correctamente dentro de los dispositivos microfluídicos a altas tasas de rendimiento, alta reproducibilidad y alta automatización, con un funcionamiento fácil y de bajo costo. Existe una demanda creciente de estas tecnologías microfluídicas en el mercado global. Este mercado se ha segmentado en hospitales y centros de diagnóstico, institutos académicos y de investigación, y compañías farmacéuticas y biotecnológicas. Los hospitales y centros de diagnóstico son las áreas con la mayor cuota de mercado en este campo. Las tecnologías microfluídicas continúan creciendo y desarrollándose con colaboraciones entre universidades e industrias.

La elección del material para los dispositivos microfluídicos es importante en el estudio de las células. En los últimos años, se han investigado materiales alternativos al vidrio y al silicio entre los materiales elastoméricos y termoplásticos. Los materiales termoplásticos compuestos por moléculas lineales y ramificadas son altamente preferidos debido a su fácil modificación de la superficie y su durabilidad contra los cambios de temperatura y presión en biorreactores de volumen, y tampoco sufren ninguna ruptura estructural. Sin embargo, no es fácil satisfacer los requisitos materiales de las aplicaciones biológicas específicas. Las propiedades ópticas, la termoestabilidad, la estabilidad química y la permeabilidad a los gases son los argumentos clave para la fabricación de dispositivos microfluídicos. Los chips termoplásticos deben ser biocompatibles para que las células sobrevivan y transparentes para poder monitorearlas. Por estas razones, el policarbonato, el polímero de olefina cíclica, el poli(metacrilato de metilo) y el poliestireno destacan en comparación con otros polímeros. Estos polímeros se utilizan comúnmente en la fabricación industrial y poseen excelentes calificaciones ópticas. Permiten la creación rápida de prototipos.

Los métodos de fabricación de los dispositivos termoplásticos son relativamente sencillos en biorreactores de volumen con tanques de acero. Las herramientas de fabricación son de bajo costo y fáciles de usar. El grabado húmedo, el mecanizado convencional, la fotolitografía, el termoestampado, el moldeo por inyección, la ablación con láser y la impresión 3D son algunos ejemplos de métodos de producción. La selección del método de fabricación depende de varios factores, como la disponibilidad de tecnología y equipo, el costo, la velocidad y la capacidad. En este capítulo, se explica la fabricación de dispositivos microfluídicos termoplásticos con y sin electrodos integrados para sistemas simples que no requieren componentes activos como microbombas, microválvulas y sensores. Se utilizan los métodos de fotolitografía, grabado, deposición, termoestampado y unión por termocompresión para la fabricación del dispositivo deseado y cada paso se explica en detalle.

Artículo completo Aquí Biorreactores de Volumen de Nanolitros para el Cultivo Celular

Métodos de estado estacionario en biorreactores

Los métodos de estado estacionario en biorreactores se basan en una reacción química o bioquímica que ocurre en el líquido, el cual actúa como absorbente de oxígeno. El método de estado estacionario se basa en el flujo de oxígeno y la diferencia entre la concentración de O2 de entrada y la concentración de O2 de salida. Este enfoque permite que el kLa cambie con el tiempo con una reducción en la concentración de oxígeno. En otras palabras, este método utiliza el balance global de oxígeno en la fase gaseosa del reactor. Pueden ocurrir errores notables debido a la pequeña diferencia en la concentración de O2 entre las corrientes de gas de entrada y salida.

El kLa es una medida del uso de oxígeno en sistemas gas-líquido. El valor de kLa es muy importante en la síntesis de productos y biomasa, ya que la obtención metabólica de energía está relacionada con el oxígeno producido por los sistemas de ventilación. Muchas variables son efectivas en el valor de kLa, también conocido como eficiencia de aireación. Estos parámetros son principalmente: turbulencia en el tanque de ventilación, es decir, mezclado, presión del aire, caudal de aire, temperatura, propiedades del fluido (densidad, viscosidad, etc.) y la disponibilidad de inhibidores de espuma.

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Para este protocolo de estado estacionario en biorreactores, el tipo de biorreactor elegido es un reactor de tanque agitado con dos deflectores. La capacidad del STR es de 3 L con un volumen de trabajo de 2 L.

1. Esparcidor: Tipo orificio.
2. Impulsor: Turbina Rushton de 6 aspas.
3. Bomba de aire: Usar con tubos de silicona.
4. Sonda de oxígeno disuelto: Tipo polarográfico.
5. Detector de temperatura.
6. Puerto de muestreo.
7. Unidad de control del biorreactor: Monitorea la temperatura, la concentración de oxígeno disuelto, la aireación (caudal de gas) y la agitación (velocidad del agitador).
8. Tanque de nitrógeno: Usar y organizar con regulador de presión.

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Obtener el cultivo de reserva de Escherichia coli como organismo modelo para la producción aeróbica en biorreactor.

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Preparar el medio de crecimiento Luria-Bertani (LB) en forma de caldo y agar para E. coli con los siguientes componentes para 1 L: 10 g de triptona, 10 g de NaCl, 5 g de extracto de levadura y agua destilada. Añadir agar-agar (2%) con estos componentes para el medio de agar.

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Utilizar la concentración celular de E. coli a una longitud de onda de 600 nm.

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Medir el tiempo y también obtener los valores de concentración de OD correspondientes a esos tiempos.

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Instalación del Biorreactor

1. Usar la forma de orificio del esparcidor de estado estacionario en biorreactores que es responsable de la entrada de burbujas de aire al biorreactor a través de la bomba de aire.
2. Localizar el puerto de la turbina Rushton en el STR (ver Nota 5).
3. Instalar el puerto de muestreo, el detector de temperatura y la sonda de OD de tipo polarográfico dentro del biorreactor.
4. Esterilizar en autoclave el biorreactor con todas sus piezas colocadas dentro durante 20 min a 121 °C.

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Preparación del Medio de Crecimiento

1. Preparar medio de agar para mantener el cultivo de reserva en placas Petri o tubos inclinados. Pesar los componentes de triptona, NaCl y extracto de levadura más agar-agar según los volúmenes requeridos y mezclarlos en el agua destilada. Hervir la solución para homogeneización.
2. Preparar los componentes del medio de caldo para la ampliación desde las placas Petri de agar hasta el volumen final de inoculación del biorreactor. Comenzar con volúmenes de 5 mL en tubos y continuar con volúmenes de 10, 20 y 40 mL, respectivamente. Pesar todos los componentes excepto el agar-agar y mezclarlos en el agua destilada en las cantidades requeridas.
3. Preparar por separado el medio de crecimiento para el biorreactor en un volumen de 2 L.
4. Medir los valores de pH de los medios de crecimiento y ajustar el pH a un rango entre 7.5 y 8.
5. Esterilizar en autoclave todos los medios de crecimiento y equipos durante 20 min a 121 °C.
6. Para el medio de agar: Poco después de la esterilización, verter el medio de caldo en condiciones asépticas en placas Petri/tubos estériles mientras la temperatura media es de aproximadamente 60 °C y dejar solidificar por enfriamiento.

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Preparación del Microorganismo

1. Inocular las células de E. coli en medio de agar con asa de inoculación en condiciones asépticas, primero. Cultivar las células a 37 °C.
2. Después de que las colonias crezcan en la placa Petri, tomar una sola colonia de la placa y transferir a 5 mL de medio de caldo. Escalar hasta 40 mL de medio de caldo en un Erlenmeyer de 250 mL siguiendo el crecimiento del cultivo.
3. Usar los 40 mL de cultivo para inocular el biorreactor.

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Operación del STR

1. Después del proceso de esterilización de estado estacionario en biorreactores, transferir el medio de crecimiento estéril al biorreactor en condiciones asépticas.
2. Inocular el 2% (v/v) de las células correspondientes a 40 mL en el biorreactor en condiciones asépticas.
3. Conectar la bomba de aire al cabezal del puerto del esparcidor con tubo de silicona.
4. Operar el STR bajo condiciones adecuadas a 150 rpm y 1 vvm (37 °C) siguiendo las indicaciones de la unidad de control del biorreactor.

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Medición del Coeficiente de Transferencia de Oxígeno: kLa

1. Verificar continuamente la densidad óptica de las células para seguir el crecimiento.
2. Después de que las células alcancen la fase de crecimiento logarítmico, estar listo para la determinación de kLa mediante el método dinámico en el biorreactor.
3. Para la desoxigenación del caldo en ese momento, conectar el  tanque de acero  de nitrógeno.
4. Inyectar gas nitrógeno en el biorreactor para desplazar el oxígeno.
5. Usar la sonda de OD y monitorear los cambios en la concentración de OD.
6. En este período, C disminuye.
7. Después de observar el valor de OD como 0% de saturación (o cerca del 0%), cortar el suministro de nitrógeno.
8. Después de que C disminuya, airear el caldo de fermentación mediante bombeo en condiciones de operación específicas, como un flujo de aire constante conocido.
9. En función del tiempo, C aumenta. Monitorear este cambio en la concentración de OD siguiendo el inicio del flujo de aire (Fig. 1).
10. Medir los valores de C en diferentes momentos en el biorreactor y registrar estos varios valores con respecto al tiempo usando un cronómetro para la gráfica.
11. Asumir que la reoxigenación del caldo de fermentación es rápida en comparación con el crecimiento celular, de modo que el nivel de OD alcanzará un valor de estado estacionario en poco tiempo. C*, que es el valor de estado estacionario, muestra un equilibrio entre el suministro y el consumo de oxígeno.

Publicado en Aquí Métodos de estado estacionario en biorreactores

Medición del Coeficiente Volumétrico de Transferencia de Masa en un Biorreactor de Tanque Agitado

Un biorreactor de tanque agitado es un recipiente controlado que permite conversiones biológicas en componentes bioactivos utilizando células o enzimas. En los procesos aeróbicos, es importante conocer los requerimientos de oxígeno de las células, que pueden variar durante la fermentación como resultado de la actividad microbiana, el envejecimiento, el agotamiento del sustrato y la formación de productos, etc. Aquí describimos la medición del coeficiente volumétrico de transferencia de masa (kLa) en un biorreactor de tanque agitado utilizando el método dinámico basado en estado no estacionario, que también es un parámetro significativo, especialmente en la ampliación de escala. El equipo para la medición según el método dinámico tiene un bajo costo en comparación con la metodología de estado estacionario. Este método es confiable en la determinación de kLa cuando el tiempo de residencia del gas y la sonda que mide la concentración de oxígeno del tiempo de respuesta cumplen con requisitos específicos.

La transferencia de gas se define como el proceso en el que el gas se mueve de una fase a otra. Este fenómeno se utiliza en la transferencia de masa y la transferencia de oxígeno para la continuidad de los procesos biológicos durante la bioproducción en un biorreactor de tanque agitado. La transición de oxígeno de la fase gaseosa a la fase líquida es crucial para el proceso aeróbico, especialmente para: la producción de enzimas, la formación de productos relacionados con la biomasa, el tratamiento de aguas residuales y los cultivos de células animales.

Los microorganismos aeróbicos en el caldo de fermentación producen la energía necesaria para su supervivencia y crecimiento utilizando moléculas de oxígeno disuelto. El oxígeno, como todos los gases en la atmósfera, se disuelve en el agua hasta cierto grado. La concentración de oxígeno disuelto (OD) depende en gran medida de la temperatura, la presión y el nivel de salinidad del agua. La concentración máxima de OD a 1 atm y temperatura ambiente es de 8.26 mg/L para agua pura.

En los bioprocesos donde intervienen microorganismos aeróbicos, es muy importante mantener el nivel deseado de concentración de OD en el caldo de fermentación. Varios organismos necesitan niveles muy altos de oxígeno para la formación de productos relacionados con la biomasa. Esto requiere una medición continua de la concentración de OD en el biorreactor de tanque agitado y un sistema de control que reaccione rápidamente cuando haya una desviación de los valores diseñados según las necesidades de los microorganismos. Debido a que el número de microorganismos en el fermentador y su tasa metabólica cambian con el tiempo, el requerimiento de oxígeno del sistema tampoco permanece constante durante la fermentación.

La concentración de OD puede variar durante la fermentación como resultado de la actividad microbiana. Se han propuesto métodos físicos y químicos para la medición del kLa en bioreactores tanque agitados (STR). En los bioprocesos, los métodos de estado estacionario y no estacionario son los más preferidos. Estos métodos tienen ventajas superiores para varios casos según su aplicación.

La técnica de estado no estacionario (también conocida como dinámica) es el método más utilizado para medir la concentración de OD. Se basa en el monitoreo de la disminución de la concentración de OD con un electrodo de oxígeno al cortar el aire (oxígeno) que alimenta el biorreactor, y el aumento de la concentración de oxígeno al realimentar el aire (oxígeno). Básicamente, el nivel de OD se espumosa con nitrógeno o se reduce a cero añadiendo sulfuro de sodio. Luego, se sigue el aumento de la concentración de OD en función del tiempo.

El método de estado no estacionario consta de dos etapas: consumo y absorción. La aireación se detiene y el OD disminuye debido a la respiración celular durante la etapa de consumo. En la etapa de absorción, se reanuda la aireación y el OD aumenta hasta alcanzar un estado estacionario. A menudo es difícil obtener un kLa preciso utilizando el método de estado no estacionario. Porque, en primer lugar, las suposiciones sobre el grado de mezcla de la fase gaseosa deben elegirse correctamente. En segundo lugar, el tiempo de respuesta del electrodo debe ser rápido. Sin embargo, es comúnmente utilizado porque da un resultado más preciso.

Durante la transferencia de oxígeno del aire al agua, la resistencia real ocurre en la capa de la película líquida en la interfaz. Dentro del biorreactor donde no se consume oxígeno, cuando se desprecia la resistencia en la fase gaseosa, el cambio dependiente del tiempo de la concentración de OD viene dado por:

qOx​=kLa​(C∗−CL​)=OTR

donde:

• kL​ es el coeficiente de transferencia de oxígeno (cm/h)
• a es el área interfacial gas-líquido (cm²/cm³)
• kLa​ es el coeficiente volumétrico de transferencia de masa (h⁻¹)
• C∗ es la concentración de oxígeno disuelto saturado (mg/L)
• CL​ es la concentración real de oxígeno disuelto en el caldo (mg/L)
• qOx​ es la velocidad de transferencia de oxígeno (mg O₂ L⁻¹ h⁻¹)

El sistema en el STR no está en estado estacionario durante la reoxigenación. En este paso, la velocidad de cambio de la concentración de OD es igual a la velocidad de transferencia de oxígeno del gas al líquido. Si la velocidad de cambio de la concentración de OD con el tiempo es igual a cero y la concentración final de OD como valor estacionario es igual a CL​ (C∗=CL​), se podría obtener una expresión.

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