Regeneración de Cartílago: Cultivo de Condrocitos en Biorreactores de Balanceo

Los biorreactores de balanceo y la medicina regenerativa han pasado de ser una promesa de ciencia ficción a una realidad clínica. Uno de los mayores desafíos actuales es la reparación del cartílago articular. A diferencia de otros tejidos, el cartílago tiene una capacidad de autorreparación extremadamente limitada debido a su falta de vasos sanguíneos.

La solución más prometedora es la reimplantación de condrocitos autólogos, pero esto presenta un reto de ingeniería: ¿Cómo podemos producir millones de células sanas, funcionales y de alta calidad en un entorno controlado y a bajo coste?

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El Dilema del Cultivo de Células Animales

Las células animales, y en particular los condrocitos CP5, son extremadamente delicadas. A diferencia de las bacterias o levaduras, estas células carecen de una pared celular rígida, lo que las hace vulnerables a dos factores críticos en el laboratorio:

1. Estrés hidrodinámico: Los biorreactores clásicos usan hélices o agitadores mecánicos que pueden "golpear" o estresar a las células.
2. Dependencia de anclaje: La mayoría de las células de mamíferos no pueden crecer flotando libremente; necesitan una superficie sólida a la cual adherirse para poder dividirse y prosperar.

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Biorreactores de balanceo

Para solucionar el problema del estrés mecánico, la tecnología ha evolucionado hacia los biorreactores de un solo uso asistidos por ondas (como el sistema ReadyToProcess WAVE 25).

¿Cómo optimizan el crecimiento celular?

En lugar de aspas giratorias en los biorreactores, estos equipos utilizan un movimiento de balanceo horizontal continuo. Este movimiento induce ondas en el sistema bifásico (gas-líquido) dentro de una bolsa de cultivo estéril.

• Oxigenación sin burbujeo: El intercambio de gases ($CO_2$ y aire) ocurre en la superficie de la onda, evitando las microburbujas que suelen dañar las membranas celulares.
• Homogeneidad Térmica y Nutritiva: El balanceo asegura que los nutrientes y los bioproductos secretados se distribuyan uniformemente sin necesidad de una agitación violenta.
• Escalabilidad: Este sistema permite pasar de pequeños volúmenes a escalas industriales manteniendo las mismas condiciones de crecimiento.

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Microportadores: Creando Superficie en la Tercera Dimensión

Como mencionamos, los condrocitos necesitan "suelo". En un biorreactor de gran volumen, esto se logra mediante microportadores (como el Cytodex 3).

Estas son pequeñas esferas de polímeros biocompatibles, con un tamaño de entre $100$ y $300 \mu m$. Su principal ventaja es la altísima relación superficie-volumen.

Dato Clave: Una pequeña cantidad de microportadores suspendidos en un litro de medio ofrece una superficie de crecimiento equivalente a cientos de placas de cultivo tradicionales (Petri), pero ocupando una fracción del espacio.

Dependiendo de la porosidad del microportador, los condrocitos pueden:

• Crecer en una monocapa sobre la superficie exterior.
• Migrar hacia el interior de microporos, donde quedan protegidos y pueden formar una matriz extracelular más densa.

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Comparativa: Sistemas Tradicionales vs. Sistemas Single-Use

¿Por qué la industria está abandonando el acero inoxidable por bolsas de plástico desechables?

Característica	Biorreactor de Acero Inoxidable	Biorreactor Desechable (WAVE)
Riesgo de Contaminación	Medio (requiere esterilización compleja)	Muy bajo (sistema cerrado y estéril)
Tiempo de Preparación	Alto (limpieza, validación, CIP/SIP)	Mínimo (listo para usar)
Flexibilidad	Baja (volumen fijo)	Alta (intercambio de bolsas de distinto tamaño)
Coste de Operación	Alto (consumo de agua y energía)	Reducido (menor infraestructura)

El Proceso de Monitoreo Diario

No basta con "encender" el biorreactor. El éxito del cultivo de condrocitos CP5 depende de un seguimiento riguroso. Un protocolo estándar incluye:

1. Control de metabolitos: Medir niveles de glucosa y lactato para asegurar que las células estén bien alimentadas.
2. Muestreo visual: Observar los microportadores bajo el microscopio para verificar el porcentaje de confluencia (qué tan "llenas" de células están las esferas).
3. Ajuste de pH y gases: Mantener el ambiente óptimo para simular las condiciones del cuerpo humano.

La combinación de biorreactores de balanceo de ondas y microportadores representa un salto cualitativo en la bioingeniería. No solo permiten obtener condrocitos de mejor calidad para tratar lesiones de rodilla o cadera, sino que reducen los costes de producción, acercando estas terapias avanzadas a un mayor número de pacientes.

La ciencia de cultivar tejidos ya no se trata solo de biología, sino de cómo diseñamos el entorno perfecto para que la vida se multiplique.

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El Futuro de la Regeneración de Tendones: Bioreactores y Células Madre en 3D

¿Cómo logramos que las células cultivadas en un laboratorio se comporten como si estuvieran dentro del cuerpo humano? La respuesta corta es: movimiento.

En el campo de la mecanobiología, estamos descubriendo que para reparar tejidos como los tendones, no basta con tener las células adecuadas; también necesitamos el entorno físico correcto. Hoy analizamos cómo el uso de bioreactores 3D está revolucionando el estudio de las Células Madre 3d Derivadas del Tendón (TDSC).

¿Qué es la mecanobiología y por qué es vital?

La mecanobiología es una disciplina fascinante que combina la biología, la ingeniería y la física. Su objetivo es estudiar cómo las células sienten y responden a las fuerzas físicas.

Los tendones son el ejemplo perfecto: conectan el músculo con el hueso y están sometidos a estiramientos constantes y repetitivos. Por eso, para estudiar sus células madre 3d (las TDSC), no podemos simplemente dejarlas en un plato de cultivo plano y estático. Necesitan sentir la fuerza.

De las 2D a las 3D: Un salto necesario

Tradicionalmente, la mayoría de los estudios se realizaban en modelos de dos dimensiones (2D). Sin embargo, las investigaciones recientes demuestran que la estimulación mecánica uniaxial en 3D ofrece un entorno mucho más realista.

Al utilizar un bioreactor personalizado para aplicar fuerza tridimensional, logramos que las células interactúen mejor con su matriz, lo que favorece la tenogénesis (la creación de tejido de tendón saludable).

Dos caminos para la regeneración: Con o sin andamios

En nuestro laboratorio, hemos desarrollado dos métodos principales para aplicar esta estimulación mecánica:

1. Método basado en andamios (Scaffold-based): Utiliza un soporte de colágeno que proporciona el espacio tridimensional para que las células se adhieran.

   • Ventaja: Es más rápido y permite el desarrollo de dispositivos biológicos implantables quirúrgicamente.

2. Método sin andamios (Scaffold-free): Se estimula a las células para que ellas mismas generen su propia matriz extracelular, formando un "organoide" de tendón.

   • Ventaja: Aunque requiere más tiempo, imita mejor el proceso biológico natural.

Dato clave: Ambos métodos han demostrado ser eficaces para activar los marcadores de tenogénesis en las células madre 3d, superando con creces los resultados de los cultivos estáticos tradicionales.

Aplicaciones más allá del tendón

Aunque este estudio se centra en los tendones, el uso de bioreactores abre puertas para otras células sensibles a la fuerza mecánica, tales como:

• Miocitos cardíacos (corazón).
• Osteocitos (hueso).
• Células endoteliales (vasos sanguíneos).

El Proceso en el Laboratorio (Resumen Técnico)

Para quienes buscan profundizar en la metodología, el proceso estándar incluye:

• Aislamiento: Obtención de TDSC de ratones (cepa C57BL/6) y su caracterización mediante citometría de flujo (CD44, CD90, etc.).
• Esterilización rigurosa: Uso de autoclave a 134 °C para los componentes de la cámara y luz UV para los motores.
• Estimulación: Uso de medios específicos enriquecidos con factores de crecimiento de tejido conectivo y ácido ascórbico.

La ingeniería de tejidos está dejando de ser una ciencia de "cultivo estático" para convertirse en una disciplina dinámica. Los bioreactores no son solo herramientas, son el puente que nos permite replicar la vida misma fuera del cuerpo.

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Bioingeniería de Tejidos: El Secreto para Restaurar la Función con Biorreactores Dinámicos

Los sistemas de biorreactores con tanques de acero que permiten simular variables in vivo en un entorno in vitro controlado supusieron un gran avance en la ingeniería de tejidos. Sin embargo, debido a las características dinámico-mecánicas que presentan algunos tejidos, las estructuras diseñadas en 3D a menudo no alcanzan las propiedades biomecánicas de los tejidos nativos.

Por lo tanto, un enfoque exitoso no solo debe lograr la reparación del tejido, sino también restaurar su función después de una lesión.

Aquí describimos un método innovador para mejorar la actividad celular en andamios 3D dentro de un sistema de biorreactor dinámico, a través de la aplicación combinada de compresión mecánica y flujo de fluidos.

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La Importancia del Estímulo Mecánico en 3D

La ingeniería de tejidos surgió como una alternativa para crear la arquitectura de tejidos bioartificiales in vitro mediante la implantación de células en andamios (scaffolds) 3D. Un factor clave es la aplicación de estímulos mecánicos durante la maduración para que el tejido naciente alcance una actividad funcional similar a la natural.

En este contexto, los sistemas de biorreactores han cobrado un interés especial, ya que permiten producir estructuras de tejido que son clínicamente efectivas.

• Se ha demostrado que la compresión mecánica en condiciones estáticas es perjudicial para el crecimiento celular.
• En contraste, la compresión dinámica promueve la actividad celular.

Un biorreactor debe cumplir dos requisitos esenciales para ser exitoso:

1. Intensificar la transferencia de masa mediante estrategias de perfusión que generen un entorno dinámico, promoviendo la proliferación y diferenciación celular.
2. Someter el tejido a cargas fisiológicamente relevantes que aceleren la producción de matriz extracelular in vitro.

Además de la difusión de nutrientes, el flujo de fluidos induce un esfuerzo cortante (shear stress) que da lugar a construcciones 3D con mayor resistencia que las desarrolladas sin estimulación mecánica. De esta manera, estos estímulos pueden actuar como antagonistas de enfoques más costosos que a menudo utilizan factores de crecimiento.

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Compresión y Dinámica de Fluidos: Una Combinación Ganadora

Un método de estimulación mecánica más directo utiliza sistemas de biorreactores de compresión (uniaxial a multiaxial). Aunque aún no existen protocolos de carga estandarizados que faciliten la comparación, los parámetros de carga dinámica son cruciales:

• Amplitud
• Frecuencia
• Duración de la carga

Por ejemplo, una carga compresiva intermitente es más eficiente que una continua, ya que el período de descanso permite a las células responder al estímulo mecánico.

El método que describimos a continuación se centra en la aplicación de dos modos de estimulación en tiempo real: carga compresiva y dinámica de fluidos. Ambos, aplicados simultáneamente y con los parámetros elegidos, proporcionan un entorno que mejora la actividad celular en andamios 3D en comparación con los cultivos estáticos estándar.

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Protocolo Detallado del Biorreactor

El tipo de célula y el material del andamio (biomateriales naturales o sintéticos) deben elegirse según la aplicación. El método aquí descrito hace referencia a parámetros probados en poliuretano modificado para la ingeniería de tejido cartilaginoso.

A. Componentes Esenciales

Todos los procedimientos deben seguir las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL).

1. Biorreactor ElectroForce: Conectado a una bomba peristáltica y ensamblado a celdas de carga de 22N. Posee cuatro módulos de fuerza, cada uno conectado a una cámara.
2. Medio de Cultivo (DMEM): 180 mL suplementados con 10% de suero fetal bovino (FBS) y antibióticos por cada cámara (la composición puede variar según el tipo de célula).
3. Tubos de Bomba de PVC de 3 vías (ajuste hermético).
4. Llaves de paso de tres vías conectadas a los tubos de la bomba.
5. Filtros de jeringa de 0,22 μM.
6. Incubadora de cultivo celular lo suficientemente grande para alojar todo el sistema del biorreactor, conectada a suministro de de CO₂.

B. Preparación Previa de Muestras

1. Esterilizar los andamios: Utilizando métodos que respeten sus propiedades fisicoquímicas (autoclave o baño UV-C son comunes). Para materiales sensibles al calor, se sugiere la desinfección con baños de alcohol seguidos de lavados en solución salina, ambos bajo vacío.
2. Siembra celular: Sembrar los andamios con el tipo de célula deseado.
3. Precápsula estático: Mantener los andamios en condiciones estáticas durante 4 días siguiendo procedimientos estándar. Este periodo es crucial para el anclaje celular y la síntesis inicial de matriz, mejorando la mecano-transducción posterior.

C. Montaje en el Biorreactor

Transferir las muestras a las cámaras del biorreactor bajo un flujo laminar estéril, con extremo cuidado para evitar daños en las células.

1. Retirar la placa de sellado acrílico de la cámara y montar el sistema de tubos de flujo en las válvulas de entrada y salida.
2. Añadir 180 mL de medio DMEM y eliminar todas las burbujas de aire del sistema de tubos.
3. Colocar el andamio entre las columnas con pinzas. Acoplar la columna superior lo suficiente sin apretar.
4. Colocar y enroscar firmemente la placa de sellado acrílico.
5. Colocar la cámara en su soporte y alinear las columnas cuidadosamente.
6. Añadir un filtro de jeringa de 0,22 μM a la abertura superior para contactar el aire restante en la cámara.
7. Colocar la cámara ensamblada en el sistema del biorreactor.

D. Configuración de Parámetros Dinámicos

Es fundamental realizar pruebas previas sin células para asegurar que los parámetros cumplan con las propiedades mecánicas del material.

1. Establecer la ruta del flujo de fluidos (idealmente a través de las columnas superior e inferior para evaluar el flujo directo a través del andamio).
2. Configurar la bomba peristáltica para un flujo continuo de 0,4 mL/min.
3. Montar la celda de carga según el rango de fuerza deseado (ver manual).
4. Configurar los parámetros de carga:

   • Valor de Fuerza: 1 N (Sistema configurado para un desplazamiento sinusoidal hasta detectar esta fuerza, garantizando una comparación homogénea).
   • Frecuencia: 0,015 Hz.
   • Duración: 1 hora continua.
   • Duración máxima: 18 horas.
   • Nota: La fuerza de 1 N se aplicó 3 veces al día, cada vez durante 1 hora, con un descanso de 1 hora sin restricciones entre cada nueva aplicación.

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El Futuro de la Medicina Regenerativa

Las células madre mesenquimales del cordón umbilical (UCMSCs) producidas en biorreactores son un recurso biológico con un enorme potencial en medicina regenerativa. Gracias a su capacidad de diferenciarse en múltiples tipos celulares y su función inmunomoduladora, estas células han demostrado resultados prometedores en la recuperación de funciones hematopoyéticas, la reparación de tejidos y la regeneración celular.

Aplicaciones de las (UCMSCs) producidas en biorreactores

Hoy en día, las UCMSCs se aplican ampliamente en ingeniería de tejidos y terapias basadas en células para tratar afecciones como el accidente cerebrovascular, lesiones de médula espinal o enfermedades neurodegenerativas.
Las UCMSCs humanas (hUCMSCs) se obtienen fácilmente del cordón umbilical tras el nacimiento, con una mínima invasión tanto para el bebé como para la madre. Además, presentan una alta capacidad de multiplicación, baja inmunogenicidad y escasas consideraciones éticas, lo que las convierte en una fuente celular muy atractiva para la investigación y el desarrollo clínico.

El reto de las (UCMSCs) producidas en biorreactores a gran escala

A pesar de su potencial, la demanda de hUCMSCs supera la oferta, ya que las dosis requeridas para lograr eficacia clínica son altas, normalmente entre 40 y 100 millones de células.
Los métodos tradicionales de cultivo celular en monocapa bajo condiciones estáticas son lentos, laboriosos y limitados en capacidad.
Aunque los sistemas automáticos de cultivo con matraces multicapa han mejorado la productividad, aún requieren grandes espacios de incubación.

La revolución del cultivo tridimensional (3D)

Para responder a esta necesidad, se ha desarrollado un proceso dinámico tridimensional (3D) de cultivo celular basado en microportadores (microcarriers) y biorreactores automatizados.
Un ejemplo destacado es el sistema desarrollado en Beijing., que combina microportadores 3D con el biorreactor 3D .

Cómo funciona este sistema innovador

Los microportadores TableTrix® ofrecen una superficie porosa donde las células madre pueden adherirse durante el cultivo en suspensión. Esta estructura aumenta significativamente la relación superficie-volumen, permitiendo una expansión celular mucho mayor.
Una de sus principales ventajas es que son totalmente solubles, lo que facilita la cosecha de las células sin necesidad de pasos adicionales de separación.
Este proceso suave ayuda a mantener la calidad celular, garantizando que las células conserven sus marcadores fenotípicos característicos (CD73, CD90 y CD105 en más del 95% de las células, y menos del 2% para CD14, CD19, CD34, CD45 y HLA-DR).

Con un solo biorreactor, es posible producir más de mil millones de células en apenas cuatro días, lo que representa un gran avance en la producción a escala industrial de hUCMSCs.

Preparación de los materiales

El protocolo de cultivo incluye el uso de microportadores estériles, soluciones específicas de digestión (como 3D FloTrix) y reactivos para control de calidad, como anticuerpos marcados para la caracterización celular.
Cada paso se realiza bajo condiciones estériles, a temperaturas controladas (entre 4 °C y 37 °C), asegurando la viabilidad y pureza de las células producidas.

El cultivo tridimensional de células madre mesenquimales representa un paso clave hacia la producción eficiente y escalable de terapias regenerativas.
Gracias a innovaciones como la biotecnología celular avanza hacia un futuro donde las terapias personalizadas y regenerativas serán más accesibles y efectivas.

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Hacia el futuro de la Terapia Celular: ¿Por qué decir adiós al suero para expandir Células Madre?

Las Células Madre Mesenquimales (hMSCs) son protagonistas en la medicina regenerativa y en el futuro de la terapia celular. Su cultivo y expansión en laboratorio son cruciales, pero el medio tradicional usado está quedando obsoleto. Aquí exploraremos el cambio fundamental hacia medios de cultivo definidos químicamente y libres de suero.

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El problema con el método tradicional (¡Adiós al Suero!)

La mayoría de los laboratorios todavía recurren a medios basales estándar como DMEM, RPMI 1640 o MEM, a los cuales se les añaden componentes para el crecimiento celular:

• Proteínas para la adhesión.
• Lípidos para el anabolismo (producción de energía y componentes celulares).
• Factores de crecimiento y hormonas.
• 10–20% de Suero Fetal Bovino (FBS).

El FBS ha sido un estándar, pero tiene serias desventajas que limitan su uso en la producción clínica:

• Alta Variabilidad Lote a Lote: La composición del suero nunca es totalmente uniforme, lo que hace que los resultados de un experimento a otro, o de un proceso de producción a otro, sean inconsistentes.
• Riesgo de Contaminación: Existe la posibilidad de contaminación con agentes como priones, virus o agentes zoonóticos (que se transmiten de animales a humanos), un riesgo inaceptable para terapias destinadas a pacientes.

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La Revolución de los Medios Definidos Químicamente y Libres de Suero

La solución es simple, pero técnicamente exigente: usar medios de cultivo químicamente definidos y libres de suero.

Ventajas Clave

1. Composición 100% Conocida: Todos los componentes son identificados.
2. Cantidades Definidas Estequiométricamente: Sabemos exactamente cuánto de cada componente hay.

Esto nos permite un control sin precedentes sobre el futuro de la terapia celular. La adaptabilidad es la gran ganadora, ya que podemos ajustar con precisión la "receta" del medio según las necesidades específicas de las células. Es un factor crucial, pues las hMSCs extraídas de diferentes tejidos (grasa, médula ósea, etc.) ¡tienen requerimientos nutricionales distintos! La tendencia futura es desarrollar medios específicos para cada tejido, en lugar de un enfoque "universal".

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Superando los Nuevos Retos: Bioreactores y Estrés Hidrodinámico

El abandono del suero trae consigo nuevos desafíos, especialmente al escalar la producción de células en bioreactores agitados (sistemas de mezcla dinámica):

• Sensibilidad al Estrés: El suero actuaba como un amortiguador contra el estrés hidrodinámico (la fuerza de agitación). Sin él, las células son más vulnerables.
• Caracterización del Proceso: Es vital realizar una caracterización del proceso previa. Hay que seleccionar cuidadosamente tanto el medio libre de suero como los microportadores (MCs), pequeñas esferas donde las células se adhieren para crecer en los bioreactores.
• Eficiencia de Adhesión Celular: La unión de las células a los MCs (la adhesión) puede ser menor sin suero.

La Sinergia Clave: Medio + Microportador (MC)

La experiencia, junto con estudios como el de Muoio et al., confirma que el medio y el microportador son inseparables. El desarrollo conjunto de un nuevo medio libre de suero y un MC adaptado a ese medio puede mejorar drásticamente la adhesión celular y el rendimiento del proceso. ¡El futuro pasa por crear MCs a medida para cada formulación de medio!

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Detalles del Proceso: De la Preparación a la Cosecha

Para alcanzar las densidades celulares necesarias para la aplicación clínica, se requiere una metodología rigurosa:

Preparación y Crecimiento

• Inóculo Adaptado: Las células usadas provienen de un banco celular que ya está adaptado al medio libre de suero.
• Evitar el Envejecimiento: Se recomienda inocular directamente el bioreactor con células descongeladas del banco de trabajo para mantener el Nivel de Duplicación Poblacional (PDL) por debajo de 15, asegurando la calidad de las células madre.
• Optimización Crucial: Antes de la producción a gran escala, se debe realizar una detección para encontrar la combinación óptima de medio y MCs.

La Fase de Cosecha

En los experimentos, la combinación F MCs con la formulación UrSuppe mostró el mejor rendimiento.

• Punto Ideal: El momento ideal para la cosecha es crucial para la calidad celular. Se determinó que se encuentra entre los días 5 y 6 de cultivo, justo antes de que las células alcancen la fase estacionaria. Cosechar 24 horas antes de la fase estacionaria garantiza la mayor viabilidad y calidad.
• Rendimiento Superior: El uso de un bioreactor de un solo uso de tanque de acero inoxidable agitado ha demostrado ser más eficiente que los spinner flasks (frascos agitados), produciendo hasta un 70% más de células viables.

En resumen en cuanto al futuro de la Terapia Celular, la transición a medios definidos químicamente y libres de suero es indispensable para la seguridad y reproducibilidad clínica. Si bien presenta desafíos operativos, la optimización detallada del medio en conjunto con los microportadores nos acerca a una producción de hMSCs más segura, controlada y eficiente.

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Producción Masiva de Células Madre Mesenquimales Humanas (hMSC) en Biorreactores de Un Solo Uso Agitados

Las células madre mesenquimales humanas (hMSC) son fundamentales en la medicina regenerativa. Su aplicación, ya sea en terapias autólogas (específicas para un paciente) o alogénicas (disponibles para cualquier paciente), dicta la escala de producción y, por ende, el tipo de biorreactor de un solo uso agitado que se debe utilizar.

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Estrategias de Expansión: Esferoides vs. Microportadores (MC)

La expansión de hMSC en biorreactores a escala de laboratorio (benchtop), suficiente para terapias autólogas, generalmente se realiza mediante dos enfoques principales: el cultivo basado en esferoides (agregados celulares) o el uso de microportadores (MC).

1. Cultivo Basado en Esferoides de Células Madre Mesenquimales

El método de esferoides permite que las células estén en contacto directo, facilitando la interacción célula-célula.

• Ventajas:

  • Evita la necesidad de material de soporte exógeno (como andamios o MCs).
  • Las células se comportan de forma similar al tejido nativo, produciendo su propia matriz extracelular (MEC), lo que les permite sobrevivir en suspensión.
  • Estas estructuras 3D pueden llevar a una mayor secreción de factores de crecimiento y antiinflamatorios.

• Desventajas y Limitaciones:

  • Es más común para el estudio de estructuras 3D complejas o la diferenciación celular en ingeniería de tejidos, que para la expansión masiva.
  • La densidad celular máxima está limitada por el tamaño y número de esferoides.
  • Los esferoides grandes (mayores de 200-300 m) son susceptibles a limitaciones de difusión de oxígeno y nutrientes, lo que puede inducir la apoptosis o la diferenciación espontánea en su núcleo.
  • Requiere la suplementación de moléculas de adhesión (como integrinas o E-cadherina) en el medio para una agregación celular exitosa.

2. Expansión en Microportadores (MC)

El uso de microportadores es una alternativa más ventajosa para la expansión masiva de hMSC, especialmente para terapias alogénicas.

• Características de los MCs:

  • Son típicamente esféricos y vienen en una variedad de tamaños (90–380 m).
  • Varían en el material del núcleo (poliestireno, celulosa, dextrano, gelatina, etc.) y en el recubrimiento superficial (colágeno, laminina, fibronectina).
  • El material y el recubrimiento son cruciales ya que afectan la adhesión celular, el crecimiento y la velocidad de agitación necesaria para mantenerlos en suspensión.

• Investigaciones Clave:

  • Estudios han demostrado que las hMSC derivadas de médula ósea crecen mejor en MCs recubiertos con colágeno y proteínas recombinantes que contienen la secuencia RGD (arginina-glicina-aspartato), la cual promueve la adhesión y el crecimiento celular.
  • Se recomienda una densidad de inoculación de 3 a 5 células por MC para optimizar la ocupación de la superficie.
  • Una distribución desigual de células en los MCs puede llevar a su agregación, lo que reduce la eficiencia del proceso de expansión.

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Escala de Producción para Terapias Alogénicas

Las terapias alogénicas requieren grandes cantidades de células para tratar a múltiples pacientes, lo que exige el uso de biorreactores a escala piloto o de producción (no solo de laboratorio).

• Preferencias a Gran Escala:

  • Debido a sus limitaciones y falta de reproducibilidad, el cultivo basado en esferoides pierde importancia a esta escala.
  • La mayor reproducibilidad del cultivo en MCs lo convierte en el método preferido para la producción de hMSC a escala industrial.

• Densidades Celulares y Medios de Cultivo:

  • Estudios han logrado densidades celulares máximas de hasta células/mL en biorreactores agitados a escala piloto (como Biostat STR® 50 L o Mobius® CellReady 50 L), utilizando medios suplementados con lisado plaquetario humano (10%) y suero fetal bovino (5% FBS).
  • Aunque las densidades alcanzadas con medios libres de suero y xenobióticos son históricamente más bajas, la reciente aparición de una amplia variedad de nuevos medios sin suero está abriendo el camino para lograr densidades de hMSC aún mayores a escala de producción en el futuro.

La elección de un sistema de biorreactor agitado de un solo uso y la estrategia de expansión (esferoides o MCs) son pasos críticos para el éxito de la producción de hMSC, siendo el uso de microportadores la opción más viable para la producción a gran escala requerida por las terapias alogénicas.

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Expansión de células madre mesenquimales (hMSCs) en biorreactores desechables agitados

Las células madre mesenquimales (hMSCs) se utilizan tanto en terapias autólogas (paciente a paciente) como en terapias alogénicas (de un donador universal para muchos pacientes). Esta diferencia determina la escala de producción necesaria, y con ello el tipo de biorreactor más adecuado.

En el caso de las terapias autólogas, los biorreactores desechables de mesa suelen ser suficientes para obtener la cantidad de células requerida. En estos sistemas, las hMSCs pueden crecer como esferoides (spheroids) o bien sobre microcarriers (MCs).

Cultivo basado en esferoides: ventajas y limitaciones

Los esferoides permiten que las células estén en contacto directo entre sí, favoreciendo la comunicación celular y una conducta más parecida a la del tejido nativo. Además, generan su propia matriz extracelular (ECM), lo que les da soporte natural.

Este enfoque es útil para estudios de diferenciación y modelos 3D, pero presenta limitaciones cuando se busca expansión masiva:

• La densidad de células madre mesenquimales está restringida al tamaño y número de esferoides.
• Esferoides grandes (>200–300 μm) pueden sufrir problemas de difusión de oxígeno y nutrientes, lo que induce apoptosis o diferenciación no deseada.

Por estas razones, aunque los esferoides son valiosos para investigación, no son la mejor opción para producción a gran escala.

Microcarriers: una alternativa para la expansión masiva

Los microcarriers (MCs) son pequeñas esferas que ofrecen una superficie de anclaje para el crecimiento celular. Existen distintos tipos que varían en tamaño, material y recubrimiento (colágeno, laminina, fibronectina, etc.).

Estudios han demostrado que las hMSCs derivadas de médula ósea crecen mejor en MCs recubiertos con proteínas de matriz extracelular, que favorecen la adhesión celular gracias a la secuencia RGD.

El éxito de este método depende tanto de la elección del MC como de la composición del medio de cultivo. Algunos biorreactores han mostrado ser altamente efectivos para mantener MCs en suspensión con baja energía, reduciendo el estrés celular.

Escalando hacia terapias alogénicas

Cuando se requieren grandes cantidades de células —como en las terapias alogénicas— se utilizan biorreactores de escala piloto o de producción (50 L o más).

Aquí los cultivos basados en esferoides pierden relevancia debido a su baja reproducibilidad, mientras que los MCs permiten procesos más estables y escalables. Con medios suplementados (ej. lisado de plaquetas humanas o suero fetal bovino), se han alcanzado densidades de hasta 0.7 × 10⁶ células/mL.

Aunque los resultados con medios libres de suero todavía son menores, los avances recientes en formulaciones comerciales libres de xenoderivados están abriendo el camino hacia una expansión más segura y eficiente para aplicaciones clínicas a gran escala.

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