Hacia el futuro de la Terapia Celular: ¿Por qué decir adiós al suero para expandir Células Madre?

Las Células Madre Mesenquimales (hMSCs) son protagonistas en la medicina regenerativa y en el futuro de la terapia celular. Su cultivo y expansión en laboratorio son cruciales, pero el medio tradicional usado está quedando obsoleto. Aquí exploraremos el cambio fundamental hacia medios de cultivo definidos químicamente y libres de suero.

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El problema con el método tradicional (¡Adiós al Suero!)

La mayoría de los laboratorios todavía recurren a medios basales estándar como DMEM, RPMI 1640 o MEM, a los cuales se les añaden componentes para el crecimiento celular:

• Proteínas para la adhesión.
• Lípidos para el anabolismo (producción de energía y componentes celulares).
• Factores de crecimiento y hormonas.
• 10–20% de Suero Fetal Bovino (FBS).

El FBS ha sido un estándar, pero tiene serias desventajas que limitan su uso en la producción clínica:

• Alta Variabilidad Lote a Lote: La composición del suero nunca es totalmente uniforme, lo que hace que los resultados de un experimento a otro, o de un proceso de producción a otro, sean inconsistentes.
• Riesgo de Contaminación: Existe la posibilidad de contaminación con agentes como priones, virus o agentes zoonóticos (que se transmiten de animales a humanos), un riesgo inaceptable para terapias destinadas a pacientes.

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La Revolución de los Medios Definidos Químicamente y Libres de Suero

La solución es simple, pero técnicamente exigente: usar medios de cultivo químicamente definidos y libres de suero.

Ventajas Clave

1. Composición 100% Conocida: Todos los componentes son identificados.
2. Cantidades Definidas Estequiométricamente: Sabemos exactamente cuánto de cada componente hay.

Esto nos permite un control sin precedentes sobre el futuro de la terapia celular. La adaptabilidad es la gran ganadora, ya que podemos ajustar con precisión la "receta" del medio según las necesidades específicas de las células. Es un factor crucial, pues las hMSCs extraídas de diferentes tejidos (grasa, médula ósea, etc.) ¡tienen requerimientos nutricionales distintos! La tendencia futura es desarrollar medios específicos para cada tejido, en lugar de un enfoque "universal".

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Superando los Nuevos Retos: Bioreactores y Estrés Hidrodinámico

El abandono del suero trae consigo nuevos desafíos, especialmente al escalar la producción de células en bioreactores agitados (sistemas de mezcla dinámica):

• Sensibilidad al Estrés: El suero actuaba como un amortiguador contra el estrés hidrodinámico (la fuerza de agitación). Sin él, las células son más vulnerables.
• Caracterización del Proceso: Es vital realizar una caracterización del proceso previa. Hay que seleccionar cuidadosamente tanto el medio libre de suero como los microportadores (MCs), pequeñas esferas donde las células se adhieren para crecer en los bioreactores.
• Eficiencia de Adhesión Celular: La unión de las células a los MCs (la adhesión) puede ser menor sin suero.

La Sinergia Clave: Medio + Microportador (MC)

La experiencia, junto con estudios como el de Muoio et al., confirma que el medio y el microportador son inseparables. El desarrollo conjunto de un nuevo medio libre de suero y un MC adaptado a ese medio puede mejorar drásticamente la adhesión celular y el rendimiento del proceso. ¡El futuro pasa por crear MCs a medida para cada formulación de medio!

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Detalles del Proceso: De la Preparación a la Cosecha

Para alcanzar las densidades celulares necesarias para la aplicación clínica, se requiere una metodología rigurosa:

Preparación y Crecimiento

• Inóculo Adaptado: Las células usadas provienen de un banco celular que ya está adaptado al medio libre de suero.
• Evitar el Envejecimiento: Se recomienda inocular directamente el bioreactor con células descongeladas del banco de trabajo para mantener el Nivel de Duplicación Poblacional (PDL) por debajo de 15, asegurando la calidad de las células madre.
• Optimización Crucial: Antes de la producción a gran escala, se debe realizar una detección para encontrar la combinación óptima de medio y MCs.

La Fase de Cosecha

En los experimentos, la combinación F MCs con la formulación UrSuppe mostró el mejor rendimiento.

• Punto Ideal: El momento ideal para la cosecha es crucial para la calidad celular. Se determinó que se encuentra entre los días 5 y 6 de cultivo, justo antes de que las células alcancen la fase estacionaria. Cosechar 24 horas antes de la fase estacionaria garantiza la mayor viabilidad y calidad.
• Rendimiento Superior: El uso de un bioreactor de un solo uso de tanque de acero inoxidable agitado ha demostrado ser más eficiente que los spinner flasks (frascos agitados), produciendo hasta un 70% más de células viables.

En resumen en cuanto al futuro de la Terapia Celular, la transición a medios definidos químicamente y libres de suero es indispensable para la seguridad y reproducibilidad clínica. Si bien presenta desafíos operativos, la optimización detallada del medio en conjunto con los microportadores nos acerca a una producción de hMSCs más segura, controlada y eficiente.

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Producción Masiva de Células Madre Mesenquimales Humanas (hMSC) en Biorreactores de Un Solo Uso Agitados

Las células madre mesenquimales humanas (hMSC) son fundamentales en la medicina regenerativa. Su aplicación, ya sea en terapias autólogas (específicas para un paciente) o alogénicas (disponibles para cualquier paciente), dicta la escala de producción y, por ende, el tipo de biorreactor de un solo uso agitado que se debe utilizar.

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Estrategias de Expansión: Esferoides vs. Microportadores (MC)

La expansión de hMSC en biorreactores a escala de laboratorio (benchtop), suficiente para terapias autólogas, generalmente se realiza mediante dos enfoques principales: el cultivo basado en esferoides (agregados celulares) o el uso de microportadores (MC).

1. Cultivo Basado en Esferoides de Células Madre Mesenquimales

El método de esferoides permite que las células estén en contacto directo, facilitando la interacción célula-célula.

• Ventajas:

  • Evita la necesidad de material de soporte exógeno (como andamios o MCs).
  • Las células se comportan de forma similar al tejido nativo, produciendo su propia matriz extracelular (MEC), lo que les permite sobrevivir en suspensión.
  • Estas estructuras 3D pueden llevar a una mayor secreción de factores de crecimiento y antiinflamatorios.

• Desventajas y Limitaciones:

  • Es más común para el estudio de estructuras 3D complejas o la diferenciación celular en ingeniería de tejidos, que para la expansión masiva.
  • La densidad celular máxima está limitada por el tamaño y número de esferoides.
  • Los esferoides grandes (mayores de 200-300 m) son susceptibles a limitaciones de difusión de oxígeno y nutrientes, lo que puede inducir la apoptosis o la diferenciación espontánea en su núcleo.
  • Requiere la suplementación de moléculas de adhesión (como integrinas o E-cadherina) en el medio para una agregación celular exitosa.

2. Expansión en Microportadores (MC)

El uso de microportadores es una alternativa más ventajosa para la expansión masiva de hMSC, especialmente para terapias alogénicas.

• Características de los MCs:

  • Son típicamente esféricos y vienen en una variedad de tamaños (90–380 m).
  • Varían en el material del núcleo (poliestireno, celulosa, dextrano, gelatina, etc.) y en el recubrimiento superficial (colágeno, laminina, fibronectina).
  • El material y el recubrimiento son cruciales ya que afectan la adhesión celular, el crecimiento y la velocidad de agitación necesaria para mantenerlos en suspensión.

• Investigaciones Clave:

  • Estudios han demostrado que las hMSC derivadas de médula ósea crecen mejor en MCs recubiertos con colágeno y proteínas recombinantes que contienen la secuencia RGD (arginina-glicina-aspartato), la cual promueve la adhesión y el crecimiento celular.
  • Se recomienda una densidad de inoculación de 3 a 5 células por MC para optimizar la ocupación de la superficie.
  • Una distribución desigual de células en los MCs puede llevar a su agregación, lo que reduce la eficiencia del proceso de expansión.

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Escala de Producción para Terapias Alogénicas

Las terapias alogénicas requieren grandes cantidades de células para tratar a múltiples pacientes, lo que exige el uso de biorreactores a escala piloto o de producción (no solo de laboratorio).

• Preferencias a Gran Escala:

  • Debido a sus limitaciones y falta de reproducibilidad, el cultivo basado en esferoides pierde importancia a esta escala.
  • La mayor reproducibilidad del cultivo en MCs lo convierte en el método preferido para la producción de hMSC a escala industrial.

• Densidades Celulares y Medios de Cultivo:

  • Estudios han logrado densidades celulares máximas de hasta células/mL en biorreactores agitados a escala piloto (como Biostat STR® 50 L o Mobius® CellReady 50 L), utilizando medios suplementados con lisado plaquetario humano (10%) y suero fetal bovino (5% FBS).
  • Aunque las densidades alcanzadas con medios libres de suero y xenobióticos son históricamente más bajas, la reciente aparición de una amplia variedad de nuevos medios sin suero está abriendo el camino para lograr densidades de hMSC aún mayores a escala de producción en el futuro.

La elección de un sistema de biorreactor agitado de un solo uso y la estrategia de expansión (esferoides o MCs) son pasos críticos para el éxito de la producción de hMSC, siendo el uso de microportadores la opción más viable para la producción a gran escala requerida por las terapias alogénicas.

Más información Aquí Producción Masiva de Células Madre Mesenquimales Humanas (hMSC) en Biorreactores de Un Solo Uso Agitados

Expansión de células madre mesenquimales (hMSCs) en biorreactores desechables agitados

Las células madre mesenquimales (hMSCs) se utilizan tanto en terapias autólogas (paciente a paciente) como en terapias alogénicas (de un donador universal para muchos pacientes). Esta diferencia determina la escala de producción necesaria, y con ello el tipo de biorreactor más adecuado.

En el caso de las terapias autólogas, los biorreactores desechables de mesa suelen ser suficientes para obtener la cantidad de células requerida. En estos sistemas, las hMSCs pueden crecer como esferoides (spheroids) o bien sobre microcarriers (MCs).

Cultivo basado en esferoides: ventajas y limitaciones

Los esferoides permiten que las células estén en contacto directo entre sí, favoreciendo la comunicación celular y una conducta más parecida a la del tejido nativo. Además, generan su propia matriz extracelular (ECM), lo que les da soporte natural.

Este enfoque es útil para estudios de diferenciación y modelos 3D, pero presenta limitaciones cuando se busca expansión masiva:

• La densidad de células madre mesenquimales está restringida al tamaño y número de esferoides.
• Esferoides grandes (>200–300 μm) pueden sufrir problemas de difusión de oxígeno y nutrientes, lo que induce apoptosis o diferenciación no deseada.

Por estas razones, aunque los esferoides son valiosos para investigación, no son la mejor opción para producción a gran escala.

Microcarriers: una alternativa para la expansión masiva

Los microcarriers (MCs) son pequeñas esferas que ofrecen una superficie de anclaje para el crecimiento celular. Existen distintos tipos que varían en tamaño, material y recubrimiento (colágeno, laminina, fibronectina, etc.).

Estudios han demostrado que las hMSCs derivadas de médula ósea crecen mejor en MCs recubiertos con proteínas de matriz extracelular, que favorecen la adhesión celular gracias a la secuencia RGD.

El éxito de este método depende tanto de la elección del MC como de la composición del medio de cultivo. Algunos biorreactores han mostrado ser altamente efectivos para mantener MCs en suspensión con baja energía, reduciendo el estrés celular.

Escalando hacia terapias alogénicas

Cuando se requieren grandes cantidades de células —como en las terapias alogénicas— se utilizan biorreactores de escala piloto o de producción (50 L o más).

Aquí los cultivos basados en esferoides pierden relevancia debido a su baja reproducibilidad, mientras que los MCs permiten procesos más estables y escalables. Con medios suplementados (ej. lisado de plaquetas humanas o suero fetal bovino), se han alcanzado densidades de hasta 0.7 × 10⁶ células/mL.

Aunque los resultados con medios libres de suero todavía son menores, los avances recientes en formulaciones comerciales libres de xenoderivados están abriendo el camino hacia una expansión más segura y eficiente para aplicaciones clínicas a gran escala.

Más información relacionada Aquí Expansión de células madre mesenquimales (hMSCs) en biorreactores desechables agitados

Biorreactores: Un Impulso a la Medicina Regenerativa para la Producción Masiva de Cardiomiocitos

Las enfermedades del corazón constituyen una de las principales causas de fallecimiento a nivel global, un desafío de salud que clama por soluciones innovadoras. El corazón, un órgano vital incapaz de sanar su propio tejido de forma eficaz, deja a los pacientes con opciones limitadas. En casos severos, el trasplante cardíaco es la única alternativa curativa. No obstante, la escasez de donantes ha generado una disparidad crítica entre la demanda y la oferta, lo que subraya la urgencia de hallar tratamientos alternativos que sean escalables y eficientes. Es aquí donde la medicina regenerativa y la tecnología de los biorreactores emergen como un rayo de esperanza para millones de personas.

El Potencial de las Células Madre Pluripotentes Inducidas (hiPSCs)

Las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) son el pilar de esta nueva era médica. Se distinguen por su excepcional capacidad de multiplicación y por su aptitud para transformarse en diversos tipos celulares, entre ellos los cardiomiocitos (CM). Estos cardiomiocitos, obtenidos a partir de células madre, poseen el potencial de reemplazar el tejido cardíaco dañado, restaurando así la funcionalidad del corazón. Sin embargo, para que esta terapia se convierta en una opción viable y esté al alcance de un gran número de pacientes, es indispensable la producción de grandes volúmenes de cardiomiocitos de alta pureza.

El principal obstáculo radica en optimizar el proceso de diferenciación de las hiPSCs hacia cardiomiocitos, garantizando su eficiencia y escalabilidad. A pesar de que las hiPSCs representan una fuente celular renovable, su manipulación en el laboratorio exige metodologías avanzadas que permitan un cultivo a gran escala y una diferenciación controlada. Esto nos conduce directamente a la necesidad de implementar sistemas sofisticados de cultivo celular, como los que ofrecen los biorreactores.

El Salto a la Producción a Gran Escala: Del Laboratorio al Biorreactor

Tradicionalmente, el cultivo de células madre se ha llevado a cabo en placas de laboratorio. Aunque este método es adecuado para la investigación en pequeña escala, resulta inviable para la producción de las enormes cantidades de células requeridas en aplicaciones clínicas. Es en este punto donde los microcarriers y los biorreactores con agitación (spinner cultures) se revelan como herramientas esenciales.

Los microcarriers son diminutas esferas a las que las células pueden adherirse y proliferar. Su uso en un biorreactor de tipo agitado permite mantener las células en suspensión en un medio de cultivo, lo cual maximiza la superficie de crecimiento disponible y posibilita una producción sustancialmente mayor que la que se obtendría en placas estáticas. La agitación regulada del biorreactor asegura una distribución homogénea tanto de las células como de los microcarriers, facilitando que todas reciban los nutrientes necesarios y que se eliminen los desechos metabólicos. Este sistema integrado de proliferación y diferenciación es crucial para materializar la visión de una fuente constante y escalable de cardiomiocitos maduros.

Un Enfoque Bifásico para la Optimización y Selección

Para asegurar el éxito de la producción, es fundamental seguir un procedimiento de dos fases para seleccionar las líneas celulares más adecuadas. La primera fase implica la evaluación del potencial de diferenciación cardíaca de las hiPSCs en cultivos de monocapa. No todas las líneas celulares se diferencian con la misma eficacia, por lo que es vital identificar aquellas con la mayor capacidad para generar cardiomiocitos. Este cribado inicial permite descartar las líneas menos prometedoras y concentrar los esfuerzos en las que poseen las características óptimas.

La segunda fase se centra en la capacidad de proliferación de estas líneas celulares previamente seleccionadas en cultivos con microcarriers dentro de un biorreactor. Una vez que se ha verificado que una línea celular puede diferenciarse de manera efectiva, es necesario confirmar que también puede crecer rápidamente en el ambiente del biorreactor con microcarriers. Esta habilidad de crecimiento a gran escala es tan importante como la capacidad de diferenciación. Únicamente las líneas celulares que demuestran un alto potencial en ambos aspectos son consideradas candidatas ideales para la producción masiva.

Un Protocolo Detallado para la Diferenciación en Biorreactores

El protocolo para la diferenciación de hiPSCs en cardiomiocitos es un proceso meticuloso que se realiza bajo condiciones estériles y controladas, usualmente en una cabina de bioseguridad. El proceso de diferenciación comienza cuando las hiPSCs, cultivadas en placas o en biorreactores sobre microcarriers, alcanzan una confluencia del 95-100%.

Se lleva a cabo un cribado inicial para determinar la concentración más efectiva del compuesto CHIR (un modulador de la vía de señalización Wnt) para cada línea celular, ya que su sensibilidad puede variar. Este paso es esencial para una diferenciación eficiente. Una vez establecida la concentración óptima, el protocolo de diferenciación generalmente sigue una secuencia de pasos:

• Día 0: Las células confluentes son expuestas a un medio de diferenciación basal que contiene la concentración óptima de CHIR durante 24 horas.
• Día 1: Tras 24 horas, el medio se cambia y las células se incuban por 24 horas adicionales.
• Día 2: El medio se sustituye por uno que contiene el compuesto IWR-1, un inhibidor de la vía Wnt, que contrarresta el efecto del CHIR y potencia la diferenciación cardíaca. Esta etapa se prolonga durante 48 horas.
• Día 4 en adelante: A partir de este momento, se realizan cambios de medio diariamente con medio fresco hasta el día 14.

Hacia el día 14, las células madre pluripotentes ya diferenciadas pueden ser disgregadas y analizadas mediante técnicas como la citometría de flujo, para verificar la pureza y la identidad de los cardiomiocitos generados. Este enfoque integrado, que va desde la selección de la línea celular hasta una diferenciación rigurosamente controlada, representa un avance significativo hacia la producción de cardiomiocitos en una escala que podría satisfacer las demandas terapéuticas.

Leer más Aquí Biorreactores: Un Impulso a la Medicina Regenerativa para la Producción Masiva de Cardiomiocitos

Biorreactores y la promesa de las células madre para regenerar el corazón.

Las enfermedades cardíacas son una de las principales causas de muerte en todo el mundo. Cuando un corazón se daña, por ejemplo, después de un ataque, sus células musculares, llamadas cardiomiocitos, no pueden regenerarse por sí solas. La única solución hasta ahora ha sido el trasplante de corazón, pero la escasez de donantes es un obstáculo enorme.

La ciencia detrás de la solución: Células madre pluripotentes en biorreactores para regenerar el corazón

Biorreactores para regenerar el corazón  - Aquí es donde entra en juego la ciencia de los biorreactores y de las células madre pluripotentes inducidas (conocidas como iPSCs por sus siglas en inglés). Estas células son extraordinarias: tienen una gran capacidad de proliferación y, lo que es aún más importante, pueden transformarse en casi cualquier tipo de célula del cuerpo, incluidos los cardiomiocitos funcionales.

El objetivo es aprovechar estas propiedades para crear un suministro ilimitado de cardiomiocitos sanos que puedan usarse para reparar el tejido cardíaco dañado. Sin embargo, para que esta terapia sea viable a gran escala, necesitamos una forma eficiente y masiva de producir estas células.

El desafío de la producción en masa en biorreactores para regenerar el corazón: Del laboratorio a la terapia

No todas las líneas de células madre se comportan de la misma manera. Algunas tienen un mayor potencial para convertirse en cardiomiocitos que otras, y sus tasas de crecimiento también pueden variar. Por ello, el primer paso en nuestro protocolo es la selección de las mejores líneas celulares.

Una vez identificadas, el siguiente desafío es cómo cultivarlas en grandes cantidades. Aquí es donde los microportadores (microcarriers) juegan un papel clave. Son pequeñas esferas sobre las que las células pueden crecer, permitiendo que se cultiven miles de millones de células en un solo biorreactor. Este sistema, en particular, se utiliza en cultivos en agitadores (spinner culture), lo que permite una producción a una escala mucho mayor que la de las placas de cultivo tradicionales.

Un enfoque integrado para la producción

Nuestro método combina estos dos pasos:

1. Evaluación inicial: Se evalúa el potencial de diferenciación cardíaca de varias líneas de células madre en un cultivo convencional para seleccionar las más prometedoras.
2. Producción optimizada: Las líneas seleccionadas se cultivan en grandes cantidades utilizando microportadores en biorreactores, para luego inducir su diferenciación en cardiomiocitos.

Este enfoque integrado nos permite superar el reto de la producción, allanando el camino para que los cardiomiocitos derivados de células madre se conviertan en una fuente terapéutica escalable para tratar enfermedades cardíacas.

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Biorreactores y Materiales y equipos clave para el proceso

Para quienes estén interesados en los detalles técnicos, aquí se listan algunos de los equipos y reactivos esenciales para llevar a cabo este protocolo.

Equipamiento mínimo:

• Gabinete de bioseguridad: Para un entorno estéril.
• Incubadoras de CO2: Para mantener las condiciones ideales de cultivo.
• Biorreactores tipo spinner: Vasos de cultivo con agitador magnético para la producción en microportadores.
• Microscopio de contraste de fases: Para observar el crecimiento celular.
• Citómetro de flujo: Para analizar las características de las células, como su pureza.

Medios y reactivos:

• mTeSR™1: Un medio de cultivo específico para mantener la pluripotencia de las células madre.
• Medios específicos para diferenciación: Como RPMI-1640 y B27 sin insulina.
• Pequeñas moléculas: Como CHIR99021 e IWR1, que se utilizan para guiar la diferenciación de las células madre hacia cardiomiocitos.
• Microportadores: Las pequeñas esferas donde las células crecen en grandes cantidades.

Con cada avance en este campo, nos acercamos un poco más a la visión de tener una fuente renovable y segura de células cardíacas, listas para restaurar la función del corazón y salvar vidas.

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Inducción de Células Progenitoras Hematopoyéticas e Inmunotinción

Para una mayor inducción de células progenitoras hematopoyéticas, las células se cultivan en medio para células progenitoras hematopoyéticas durante otros 3 a 5 días.

Apague el sistema de control electrónico en los biorreactores y retire con cuidado los frascos T12.5 del rotador de accionamiento biaxial.

Aspire el medio de diferenciación de células progenitoras del endotelio hemogénico y añada unos 30 mL de medio para células progenitoras hematopoyéticas en los frascos T12.5 del grupo RPM.

Coloque los frascos T12.5 en el rotador de accionamiento biaxial y vuélvalos a introducir en la incubadora de CO2 durante 3 días más de cultivo celular.

Cambie el medio con medio fresco para células progenitoras hematopoyéticas de medio volumen cada dos días.

Después de 3 días de cultivo en medio para células progenitoras hematopoyéticas, se forman muchos cúmulos con forma de uva y muchas células redondas flotan en el medio. Las células progenitoras hematopoyéticas diferenciadas se caracterizan por los marcadores de superficie CD34 y CD43.

En el día 2, 5 y 8 del cultivo, las células diferenciadas en los frascos bajo diferentes condiciones de cultivo se recogen y se preparan para la inmunotinción.

Retire el medio de los frascos y añada PBS a las células para lavarlas 1 o 2 veces.

Aspire el PBS y luego fije con una solución de paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 20 a 30 minutos.

Lave las células una vez con PBS y la base de los frascos se divide en pequeños trozos (de 1 cm x 1 cm) con cuchillas afiladas.

Coloque cada pequeño trozo que contenga células en un plato de cultivo celular de 24 pocillos y añada PBS al pocillo.

Permeabilice las células durante 20 minutos con Triton X-100 al 0.2% y suero de burro al 1% a temperatura ambiente (ver Nota 7).

Lave las células dos veces con PBS y añada la solución bloqueante de suero de burro al 5% al pocillo para un bloqueo de 1 hora a 37 °C.

Prepare el anticuerpo primario en suero de burro al 5% en las diluciones recomendadas por el fabricante.

Incube las células en la solución de anticuerpo primario durante toda la noche a 4 °C (o 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpos conjugados con colorantes fluorescentes).

Lave las células tres veces con PBS para reducir el fondo fluorescente.

Prepare la solución mezclada que contiene el segundo anticuerpo (diluciones 1:200) y Hoechst 33342 (0.1–1 μg/mL) en PBS con suero de burro al 5%.

Incube las células en la solución mezclada durante 1 hora a temperatura ambiente.

Lave las células dos veces durante 5 minutos en PBS.

Ponga una gota de medio de montaje, añada un cubreobjetos y selle con esmalte de uñas.

Observe las láminas y adquiera la imagen bajo el microscopio confocal.

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Preparación para Inmunotinción (Días 5 y 8)

En el día 5 y 8 del cultivo, las células diferenciadas en los frascos bajo diferentes condiciones de cultivo se recolectan y se preparan para la inmunotinción.

Disocie las células en células individuales con tripsina al 0.05% y EDTA al 0.1%.

Añada solución inhibidora de tripsina y centrifuge durante 5 minutos a 500 g y 4 °C y deseche el sobrenadante.

Lave las células con tampón de lavado celular (PBS que contiene BSA al 5%).

Cuente las células y resuspéndalas en BSA al 5% en PBS a 1×106 células/mL.

Transfiera 50 μL de suspensión celular a tubos de ensayo.

Añada los anticuerpos primarios purificados y conjugados con fluorescencia diluidos (CD31, CD34 y CD43) a los tubos de ensayo en las diluciones recomendadas por el fabricante. Los controles incluyen: negativo (sin tinción añadida), control de isotipo (con anticuerpo primario no específico etiquetado de manera similar).

Incube en hielo durante 30 minutos en la oscuridad.

Lave cada muestra tres veces con 2 mL de tampón de lavado celular, centrifugue a 500 g durante 5 minutos a 4 °C.

Añada 500 μL de PBS a cada pellet y resuspenda la muestra celular.

Examine las muestras celulares usando el citómetro de flujo FACS Calibur (BD).

Analice los datos con el software FlowJo, versión 10.0.7.

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Notas Adicionales

Si no se va a usar inmediatamente, la placa de cultivo recubierta debe sellarse con parafilm para evitar la evaporación de la solución de Matrigel® y las placas se pueden almacenar a 2–8 °C hasta por 1 semana después del recubrimiento.

Cuando la disociación celular dure aproximadamente 2 minutos en la incubadora, debe verificar el estado de las células para asegurarse de que las colonias estén sueltas y se desprendan del fondo del plato o frasco. No digiera en exceso las células para generar una suspensión de células individuales.

Resuspenda suavemente el pellet celular con una pipeta para evitar generar una suspensión de células individuales. El tamaño de los agregados celulares se puede ajustar alterando el número de veces que la mezcla de agregados celulares se pipetea hacia arriba y hacia abajo. Tenga cuidado de mantener las células como agregados.

Siembre los agregados celulares a una densidad óptima en el frasco (aproximadamente 100 agregados/cm²). No siembre demasiado denso ni demasiado disperso.

El frasco debe llenarse con un medio de cultivo celular y asegúrese de que la burbuja se extraiga en el grupo RPM.

La alimentación del sistema de control electrónico debe apagarse al preparar el cambio del medio celular.

Este paso se puede omitir cuando se tiñen las células con anticuerpos CD31, CD34 o CD43.

Más información Aquí Inducción de Células Progenitoras Hematopoyéticas e Inmunotinción

Expansión de Células Madre Pluripotentes Humanas sin Células Alimentadoras

En cuanto a las Células Madre Pluripotentes Humanas, antes de la diferenciación de las células madre embrionarias humanas (CEEh), las CEEh no diferenciadas y dependientes de alimentadoras se cultivan en condiciones libres de alimentadoras y químicamente definidas con el uso del medio TeSR™-E8™ en placas recubiertas con Matrigel Matrix HESC-qualified (Bio-Coat). Podemos omitir este paso si las CEEh se mantienen en medio TeSR™-E8™. Las siguientes instrucciones son las que se utilizan en los experimentos.

Antes de descongelar o pasar las CEEh, recubrir una nueva placa de 6 pocillos con una solución de Matrigel Matrix, y preincubar a temperatura ambiente (25 °C) durante al menos 1 h antes de usar.

• Retirar la solución de Matrigel Matrix con una pipeta o por aspiración.
• Añadir 2 mL de medio TeSR™-E8™ a la placa de 6 pocillos.
• Colocar la mezcla de agregados celulares pequeños (500–1000 agregados/pocillo) en la placa de 6 pocillos que contiene TeSR™-E8™ y observar el estado de los agregados celulares bajo el microscopio para asegurar la densidad celular deseada.
• Colocar la placa de 6 pocillos en una incubadora de CO₂ a 37 °C. Mover la placa con movimientos hacia adelante y atrás y de lado a lado para distribuir uniformemente los pequeños agregados celulares.
• Cambiar el medio diariamente con TeSR™-E8™ y monitorear el crecimiento celular a diario hasta el siguiente pasaje o la diferenciación celular.

Antes de la inducción del mesodermo, recubrir cada matraz T12.5 con 1.5 mL de Corning Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix diluido a temperatura ambiente durante 30 min y luego incubar los matraces a 37 °C durante otros 30 min.

• En el momento del pasaje celular, digerir las colonias de células  de células madre pluripotentes humanas (CPHh) en pequeños agregados celulares con ReLeSR™ a 37 °C durante unos 3 min.

• Detener la digestión con TeSR™-E8™ en el biorreactor, golpear suavemente la placa de cultivo para asegurarse de que los pequeños agregados celulares se desprendan del fondo de la placa.
• Recolectar los agregados celulares en un tubo de centrífuga de 15 mL y pipetear la suspensión de agregados celulares suavemente hacia arriba y hacia abajo unas 3–5 veces para ajustar el tamaño de los agregados a 100–200 células/agregado.
• Centrifugar los agregados recolectados a 500 rpm durante 5 min a temperatura ambiente, retirar el sobrenadante del tubo de centrífuga de 15 mL y resuspender los pequeños agregados celulares en 2 mL de TeSR™-E8™.

• Retirar el líquido de los matraces T12.5 recubiertos con Corning y añadir 2 mL de TeSR™-E8™ al matraz.
• Sembrar los agregados celulares en el matraz T12.5 recubierto con Matrigel de Corning a una densidad de aproximadamente 100 agregados/cm2 en TeSR™-E8™.
• Colocar los matraces en la incubadora de CO₂ (37 °C, 5% de CO2​ y 95% de humedad) y agitar los matraces con varios movimientos rápidos de lado a lado y de adelante hacia atrás para distribuir uniformemente los agregados.
• Verificar el estado de crecimiento de las colonias celulares al segundo día; si el tamaño de las colonias supera los 300 μm, deberían estar listas para ser cambiadas al medio de diferenciación.
• Aspirar el medio del matraz T12.5 y añadir 5 mL de medio de inducción del mesodermo, colocar los matraces en una incubadora para cultivar durante 2 días.
• Después de 2 días de cultivo en medio de inducción del mesodermo, hemos observado que casi todas las colonias exhiben una apariencia de colonia suelta y una morfología celular alargada, y dan lugar a células diferenciadas Brachyury.

Después de 2 días de inducción del mesodermo, las células de células madre prrrrrrrrr pluripotentes se cultivan adicionalmente cambiando al medio de diferenciación de células progenitoras de endotelio hemogénico. Algunos de los matraces T12.5 con células inducidas a mesodermo se colocan en el rotador de accionamiento biaxial. Los matraces T12.5 y el rotador de accionamiento biaxial se colocan en la incubadora de CO₂ para el cultivo celular.

• Aspirar el medio de inducción del mesodermo y añadir 30 mL de medio de diferenciación de células progenitoras de endotelio hemogénico a los matraces T12.5 del grupo RPM y añadir 5 mL de medio a los matraces T12.5 del grupo de control (ver Nota 5).
• Poner los matraces T12.5 del grupo RPM en el rotador de accionamiento biaxial.
• Colocar el rotador de accionamiento biaxial con los matraces T12.5 y los matraces T12.5 del grupo de control en la incubadora de CO₂ a 37 °C con 5% de CO2​ y 95% de humedad para la inoculación y cultivo celular.
• Encender el sistema de control electrónico y configurarlo en modelos de velocidad aleatoria (0.1–10 rpm).
• Cambiar la mitad del volumen del medio por medio fresco de diferenciación de células progenitoras de endotelio hemogénico cada dos días.
• Después de 3 días de cultivo de células madre pluripotentes en medio de diferenciación de células progenitoras de endotelio hemogénico, en el grupo RPM surgieron células con morfología endotelial y estructuras tubulares. Algunas células diferenciadas contenían células redondas con cúmulos "en forma de uva". Las células diferenciadas se caracterizan por los marcadores de superficie CD31 y CD34.

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